Lucifer Yellow - Un marcador de permeabilidad paracelular robusto en un modelo celular de la barrera hematoencefálica humana

Summary

Presentamos un ensayo de fluorescencia para demostrar que Lucifer Yellow (LY) es un marcador robusto para determinar la aparente permeabilidad paracelular de las monocapas celulares hCMEC/D3, un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica humana. Usamos este ensayo para determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas.

Abstract

La barrera hematoencefálica BBB consiste en células endoteliales que forman una barrera entre la circulación sistémica y el cerebro para evitar el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas. Las uniones estrechas (TJ) sellan eficazmente el espacio paracelular en las monocapas, lo que resulta en una barrera intacta. Este estudio describe un ensayo de fluorescencia basado en LY que sepuede utilizar para determinar su coeficiente de permeabilidad aparente (aplicación P) y a su vez se puede utilizar para determinar la cinética de la formación de monocapas confluentes y la unión estrecha resultante integridad de barrera en las monocapas hCMEC/D3. Demostramos además una utilidad adicional de este ensayo para determinar la integridad funcional de TJ en células transinfectadas. Nuestros datos del ensayo de la_aplicación LY P muestran que las células hCMEC/D3 sembradas en una configuración transwell limitan efectivamente el transporte paracelular LY 7 días de cultivo. Como utilidad adicional del ensayo presentado, también demostramos que la transfección de nanopartículas de ADN no altera el transporte paracelular LY en monocapas hCMEC/D3.

Introduction

La barrera hematoencefálica (BBB) es la barrera protectora que limita la afluencia de componentes plasmáticos en el tejido cerebral y consiste en células endoteliales cerebrales junto con células de apoyo como los pericitas. El papel principal de BBB es servir como barrera que sella el espacio entre la sangre periférica y elsistema nervioso central (SNC) para mantener la hemostasis del microambiente neural 1,^2. Las células endoteliales capilares cerebrales sellan eficazmente la vía paracelular a través de la formación de uniones estrechas intercelulares (TJ)¹. Esta barrera protectora permite que la glucosa y los nutrientes seleccionados entren en el cerebro mientras evita que la mayoría de los iones, sustancias tóxicas y drogas pasen a través de esta barrera apretada. Aparte de su función protectora, la función de barrera natural del BBB plantea un grave desafío en el desarrollo de sistemas de administración de medicamentos dirigidos al SNC.

Los modelos de cultivo celular in vitro del BBB son herramientas útiles para estudiar su biología y comprender los efectos del tratamiento farmacológico en la integridad de la barrera TJ. Utilizamos la línea celular endotelial microvascular humana (hCMEC/D3) como modelo in vitro ya que es un modelo aceptado de endotelio cerebral humano³ y recapitula muchas funciones de la BBB humana. hCMEC/D3 es una de las líneas celulares más utilizadas para modelar el BBB in vitro^4,5,6,7,8,9. A pesar de sus valores comparativamente bajos de resistencia eléctrica transendotelial (TEER), una medida de la estanqueidad de las barreras, esta línea celular conserva la mayoría de las propiedades morfológicas y funcionales de las células endoteliales cerebrales, incluso como monocultivo en ausencia de células gliales cocultivadas^6,7. La línea celular hCMEC/D3 expresa múltiples marcadores BBB incluyendo transportadores y receptores activos hasta aproximadamente el paso 35 sin someterse a desdiferencia a fenotipos inestables^{6,7,9 ,10,11}. La característica más llamativa de la línea celular hCMEC/D3 como modeloBBB in vitro es su capacidad para formar TJs 5,^9,11,12. Cabe señalar que aunque los modelos BBB derivados de células madre mostraron una mayor permeabilidad en muchos estudios en comparación con la línea celular hCMEC/D3 y expresan algunos marcadores BBB, todavía no han evolucionado como el modelo de células BBB más común^13. Es importante destacar que los modelos BBB derivados de células madre siguen siendo caracterizados con respecto a los números máximos de pasaje que permiten a las células mantener fenotipos BBB estables^14.

Tres métodos primarios se utilizan comúnmente para determinar la integridad de la barrera TJ, incluyendo la medición del TEER, la medición del coeficiente de permeabilidad aparente_(aplicaciónP) de pequeñas moléculas de trazador hidrófilo como sacarosa, inulina, Lucifer Yellow, etc. e inmunomanchación de marcadores moleculares conocidos de TJs como claudin-5, ZO-1, occludin, etc.⁵. TEER es un método relativamente simple y cuantitativo que mide la resistenciaeléctrica a través de las monocapas celulares cultivadas en un sustrato de membrana porosa 5. Sin embargo, los valores TEER pueden verse influenciados por variables experimentales como la composición del medio de cultivo y el tipo de instrumento de medición. Una combinación probable de estos factores conduce a una amplia distribución de los valores TEER que van de 2 a 1150 cm² en la línea celular hCMEC/D3 cultivada durante 2-21 días^13. La inmunomancha es un método visual para determinar la presencia de proteínas TJ mediante el etiquetado de la proteína objetivo utilizando anticuerpos. Sin embargo, la inmunomancha implica una serie de pasos experimentales, incluyendo la necesidad de fijar/permeabilizar las células que pueden resultar en artefactos experimentales y las señales fluorescentes pueden desvanecerse con el tiempo. Los factores anteriores pueden dar lugar a errores subjetivos que afectan a la calidad de los datos.

El enfoque principal de este trabajo es presentar un ensayo de permeabilidad aparente basado en LY determinar la cinética de una formación monocapa confluente en células hCMEC/D3 cultivadas. Aunque otros sistemas avanzados de BBB in vitro, como los sistemas de cocultivo, los sistemas microfluídicos, son imitaciones fisiológicamente más relevantes con una función de barrera significativamente mejorada^15,16,17, el hCMEC/D3 configuración de transwell es un modelo simple y confiable para estimar la cinética de la formación de TJ y examinar rápidamente el efecto de diferentes formulaciones de fármacos en la función de barrera. En general, los valores de la_aplicación P son consistentes para varios solutos hidrófilos en monócapas hCMEC/D3. Por ejemplo, los valores de_aplicación P reportados para varios solutos de baja masa molecular (como sacarosa, manitol, LY, etc.) en diferentes modelos BBB in vitro están en el orden de 10^-4 cm/min 5,^{18,19 , 20}. En nuestra configuración experimental, las células endoteliales cerebrales se sembran en una membrana microporosa recubierta de colágeno para la unión celular y la formación de monocapa para imitar la barrera in vivo. Se espera que el LY añadido en el lado apical atraviese las uniones estrechas intercelulares y se acumule en el lado basolateral. Las mayores concentraciones de LY en el lado basolateral indican una barrera inmadura, no completamente funcional, mientras que las concentraciones más bajas reflejan el transporte restringido debido a la presencia de TJs funcionales que resultan en una barrera madura.

LY es un tinte hidrófilo con picos de excitación/emisión distintos y evita la necesidad de radioetiquetar moléculas trazadoras como sacarosa, manitol o inulina. Por lo tanto, los valores de fluorescencia de LY se pueden utilizar para calcular directamente su permeabilidad paracelular a través de las monocapas BBB. Además, en comparación con muchos tintes disponibles comercialmente utilizados en campos biomédicos que sufren de pequeños cambios Stokes como fluoresceína²¹, el desplazamiento Stokes de LY es de aproximadamente 108 nm con suficiente separación espectral, permitiendo así datos de fluorescencia LY como lectura robusta para determinar la permeabilidad paracelular. Usamos la hincha occidental como una técnica ortogonal para demostrar los cambios en la expresión de la proteína marcador de unión apretada, ZO-1, durante el tiempo de cultivo. La expresión ZO-1 detectada a través de la hincha occidental se utiliza para complementar los datos de la_aplicación LY P y, en combinación, estos datos sugieren que los cambios observados en los valores de la_aplicación LY P reflejan la formación de una monocapa con aumento gradual en expresión del marcador de unión estrecha, ZO-1.

Como se señaló anteriormente, el enfoque central de este trabajo es demostrar un ensayo LY como una técnica simple para monitorear la formación de una monocapa confluente con uniones estrechas funcionales. Sin embargo, para demostrar una utilidad adicional del ensayo desarrollado, medimos la_aplicación LY P en monócapas hCMEC/D3 transfectó nanopartículas de ADN. Los ácidos nucleicos se pueden condensar en nanopartículas de polielectrolitos con un diámetro de 100-200 nm mediante interacción electrostática entre los grupos de polímeros cargados positivamente y los grupos fosfatos cargados negativamente de ácidos nucleicos^{22, 23}. Nos referimos a estos complejos como nanopartículas de ADN (NPs de ADN) en nuestro trabajo. Si bien nuestra intención es transfectar las células y expresar la proteína deseada, debemos asegurarnos de que las propiedades de barrera de las monocapas hCMEC/D3 no se vean comprometidas. Nuestros datos sugieren que un régimen estándar de transfección del gen luciferasa de 4 h no cambia mediblemente la permeabilidad LY que demuestra la utilidad del ensayo de la_aplicación LY P para determinar los cambios en la integridad de la barrera TJ.

Protocol

1.Cultivo celular general hCMEC/D3 Reanimación de células congeladasNOTA: Todos los experimentos y mantenimiento del cultivo celular se realizaron dentro de una campana de bioseguridad estéril. Los medios de cultivo, los suplementos y los reactivos se compraron como productos estériles o se esterilizaron mediante filtración utilizando un filtro de membrana de 0,22 m para evitar la contaminación microbiana. Añadir 8,5 ml de solución de colágeno (0,15mg/ml) en un matraz de cu…

Representative Results

En primer lugar, determinamos el efecto del tiempo de cultivo en la permeabilidad LY para determinar la cinética aparente de la formación de TJ. Los valores medios de laaplicación LY P del día 1 a 10 post de la sesión se muestran en la Figura 2a. En el día 1, laaplicación P media era de 4,25 x 10-4 cm/min y cayó ligeramente a 3,32 x 10-4 cm/min el día 2. El valor medio de laaplicación P aumentó…

Discussion

Un papel clave del BBB es prevenir el intercambio de iones no esenciales y sustancias tóxicas entre la circulación sistémica y el cerebro para mantener la hemostasis del microambiente neural. Una de las características características del BBB es la capacidad de las células endoteliales capilares para formar uniones estrechas (TJ) que sellan eficazmente la ruta paracelular de transporte. Demostramos un ensayo de_aplicación LY P como un método cuantitativo para determinar la cinética aparente de la forma…

Materials

hCMEC/D3 cell line	Cedarlane Laboratories	102114.3C-P25	human cerebral microvascular endothelial cell line
gWizLuc	Aldevron	5000-5001	Plasmid DNA encoding luciferase gene
lucifer yellow CH dilithium salt	Invitrogen	155267
Transwell inserts with polyethylene terephthalate (PET) track-etched membranes	Falcon	353095
Tissue culture flask	Olympus Plastics	25-207
24-well Flat Bottom	Olympus Plastics	25-107
Black 96-Well Immuno Plates	Thermo Scientific	437111
S-MEM 1X	Gibco	1951695	Spinner-minimum essential medium (S-MEM)
EBM-2	Clonetics	CC-3156	Endothelial cell basal medium-2(EBM-2)
phosphate-buffered saline 1X	HyClone	SH3025601
Collagen Type I	Discovery Labware, Inc.	354236
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227
Cell Culture Lysis 5X Reagent	Promega	E1531
Beetle Luciferin, Potassium Salt	Promega	E1601
SpectraMax i3	Molecular Devices		Fluorescence Plate Reader
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
ZO-1 Polyclonal Antibody	ThermoFisher	61-7300
anti-GAPDH antibody	abcam	ab8245
Alexa Fluor680-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L)	Jackson ImmunoResearch Inc	128817
12-well, Flat Bottom	Olympus Plastics	25-106
RIPA buffer (5X)	Alfa Aesar	J62524
Aprotinin	Fisher BioReagents	BP2503-10
Odyssey CLx imager	LI-COR Biosciences		for scanning western blot membranes