Summary

Merkel Cell Polyomavirus Infection et détection

Published: February 07, 2019
doi:

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à infecter primaire fibroblastes dermiques humains avec MCPyV. Le protocole prévoit l’isolement des fibroblastes dermiques, préparation des virions MCPyV, infection par le virus, immunofluorescence souillant et fluorescence hybridation in situ. Ce protocole peut être étendu pour la caractérisation des interactions hôte-MCPyV et découvrir d’autres types de cellules susceptible d’être infectés par MCPyV.

Abstract

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) infection peut mener à carcinome de cellules de Merkel (MCC), une forme très agressive de cancer de la peau. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV la biologie moléculaire et mécanismes oncogènes ont été entravés par un manque de modèles de culture de cellules adéquates. Nous décrivons ici une série de protocoles d’effectuer et de détecter l’infection des cellules de peau humaine primaire MCPyV. Les protocoles décrivent l’isolement des fibroblastes dermiques humains, préparation des recombinants MCPyV virions et détection de l’infection par le virus par immunofluorescence (IF) et la réaction en chaîne in situe hybridation de l’ADN (HCR), qui est un très sensible fluorescence en approche de situ hybridation (poisson). Les protocoles dans les présentes peuvent être adaptés par les chercheurs intéressés à identifier d’autres types de cellules ou lignées de cellules qui prennent en charge de l’infection MCPyV. L’approche décrite de poisson pourrait également être adapté pour détecter de faibles niveaux d’ADN viral présent dans la peau d’humaine infectée.

Introduction

Merkel cell polyomavirus (MCPyV) est un virus à ADN double brin petit qui a été associé à un cancer de la peau rare mais agressif, Merkel cell carcinoma (MCC)1,2. Le taux de mortalité du MCC, environ 33 %, dépasse celle du mélanome3,4. MCPyV possède un génome circulaire de ~ 5 kb1,5 , coupée en deux par une région régulatrice non codantes (RRRNC) en début et fin de codage régions1. Le RRRNC contient l’origine virale de la réplication (Ori) et promoteurs bidirectionnel pour transcription virale6,7. La région début encode les protéines de l’antigène tumoral grand T (LT), petit T (sT), 57kT, alternative LT ORF (ALTO), ainsi qu’une autorégulation miRNA1,8,9,10. La région fin encode les protéines de la capside VP1 et VP211,12,13. LT et sT sont les protéines de MCPyV mieux étudiés et auraient dû être divulgués à l’appui de la réplication de l’ADN virale et tumorigenèse induite par le MCPyV5. L’intégration clonale de MCPyV ADN dans le génome hôte, qui a été observée chez 80 % de CCM, est probablement un facteur causal pour séropositifs au virus de tumeur développement14,15.

L’incidence de la MCC a triplé sur les dernières vingt années16. Infection asymptomatique de MCPyV est également répandue dans la population générale17,18,19. Avec le nombre croissant de diagnostic de la CMC et la forte prévalence de l’infection à MCPyV, il est nécessaire d’améliorer notre compréhension du virus et son potentiel oncogène. Cependant, beaucoup d’aspects de la biologie de la MCPyV et mécanismes oncogènes demeure mal compris20. C’est en grande partie parce que les MCPyV se reproduit mal dans cellulaires établies lignes11,12,21,22,23 et, jusqu’à tout récemment, la peau des cellules capables de supporter MCPyV l’infection n’avait pas été découvert22. Des études mécanistes pour enquêter pleinement sur MCPyV et son interaction avec les cellules hôtes ont été entravés par l’absence de système de culture cellulaire pour propager le virus5.

Nous avons découvert que les fibroblastes dermiques humains primaires (HDFs) isolement d’infection de prépuce humains néonatale soutien robuste MCPyV les deux in vitro et ex vivo24. De cette étude, nous avons créé le premier modèle d’infection de culture cellulaire pour MCPyV24. S’appuyant sur ce système modèle, nous avons montré que l’induction de gènes de matrix métalloprotéinases (MMP) par la voie et autres facteurs de croissance de signalisation WNT/β-caténine stimule l’infection MCPyV. En outre, nous avons constaté que le MEK approuvé par la FDA antagoniste trametinib inhibe efficacement MCPyV infection5,25. De ces études, nous avons aussi établi un ensemble de protocoles pour l’isolement des fibroblastes dermiques humains24,25, préparation des virions de MCPyV11,12, effectuant une infection MCPyV sur fibroblastes dermiques humains 24 , 25 et détecter les protéines MCPyV par IF coloration26. En outre, nous avons adapté l’in situ ADN hybridation réaction en chaîne (HCR) technologie27 pour développer une technique de poissons très sensible (HCR-DNA FISH) pour la détection des MCPyV ADN dans les cellules infectées de la peau humaine. Ces nouvelles méthodes seront utiles pour étudier le cycle infectieux de MCPyV ainsi que la réponse cellulaire à l’infection MCPyV. Les cellules de réservoir hôte naturel qui maintiennent l’infection MCPyV et les cellules qui donnent lieu à des tumeurs MCC demeurent inconnues. Les techniques que nous décrivons dans ce manuscrit pourraient être appliquées afin d’examiner les différents types de cellules humaines d’identifier aussi bien les cellules du réservoir et l’origine des tumeurs MCC. Nos méthodes établies, comme le HCR-ADN poisson, pourraient aussi servir à la détection d’autres virus de tumeur d’ADN et la caractérisation des interactions cellule hôte.

Protocol

Prépuces néonatales humains proviennent de Penn Skin Disease Research Center. Fibroblastes humains adultes proviennent de peau normale au rebut après la chirurgie. Tous les protocoles ont été approuvés par l’Université de Pennsylvanie Institutional Review Board. 1. isolement des fibroblastes dermiques humains Utilisez une paire de ciseaux pour couper les tissus gras et sous-cutanée de prépuce néonatal humain et couper l’échantillon de peau en demis ou quarts. <li…

Representative Results

Le protocole décrit dans ce manuscrit a permis l’isolement d’une population presque homogène du HDFs (Figure 1). Tel que démontré par immunofluorescence, presque 100 % des cellules dermiques humains isolés utilisant les conditions décrites dans le présent protocole ont été positivement colorées pour les marqueurs des fibroblastes dermiques, vimentine et collagène j’ai24, mais négatif pour l’homme marqueur de kérati…

Discussion

Les méthodes décrites ci-dessus, y compris l’isolement des fibroblastes dermiques de tissus de la peau humaine, la préparation des virions de MCPyV recombinantes, l’infection de cellules cultivées, immunofluorescence et une méthode sensible de poisson adapté de la technologie HCR, qui devrait permettre aux chercheurs d’analyser MCPyV infection27. Une des étapes plus critiques pour atteindre MCPyV infection in vitro est la production de préparations de haut-titre virion. Utilisant le …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiens à remercier le Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) et Dr M. Celeste Simon (Université de Pennsylvanie) pour la fourniture de réactifs et support technique. Nous remercions également les membres de nos laboratoires de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (NIH) subventions (R01CA187718, R01CA148768 et R01CA142723), la subvention d’appui NCI Cancer Center (NCI P30 CA016520) et le prix Penn CFAR (P30 Ia 045008).

Materials

Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

References

  1. Gjoerup, O., Chang, Y., Vande Woude, G., Klein, G. . Advances in Cancer Research. 106, 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974 (2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161 (2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181 (2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558 (2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499 (2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468 (2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112 (2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018)
  30. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018)
  31. . ccr.cancer.gov Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018)

Play Video

Cite This Article
Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

View Video