Summary

Merkel-Zell-Polyomavirus Infektion und Erkennung

Published: February 07, 2019
doi:

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären menschlichen dermalen Fibroblasten mit MCPyV zu infizieren. Das Protokoll enthält Isolation der dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von MCPyV Virionen, Virusinfektion, Immunfluoreszenz-Färbung und Fluoreszenz in Situ Hybridisierung. Dieses Protokoll kann für die Charakterisierung von MCPyV-Wirt Interaktionen und entdecken andere Zelltypen infizierbar durch MCPyV erweitert werden.

Abstract

Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) Infektion kann zum Merkel-Karzinom (MCC), eine sehr aggressive Form von Hautkrebs führen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV Molekularbiologie und onkogenen Mechanismen zu untersuchen haben durch einen Mangel an ausreichenden Zellmodelle Kultur erschwert. Hier beschreiben wir eine Reihe von Protokollen für die Durchführung und Nachweis MCPyV Infektion der primären menschlichen Hautzellen. Die Protokolle beschreiben die Isolation der menschlichen dermalen Fibroblasten, Vorbereitung von rekombinanten MCPyV Virionen und Nachweis von Virus-Infektion durch immunofluorescent (IF) Färbung und in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR), die sehr empfindlich ist Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) Ansatz. Die Protokolle hierin können angepasst werden, indem interessierte Forscher identifizieren, andere Zelltypen oder Zell-Linien, die MCPyV Infektion unterstützen. Die beschriebene Vorgehensweise der Fisch könnte auch zur Erkennung von niedrigen Niveau der viralen DNA in die infizierten menschlichen Haut angepasst werden.

Introduction

Merkel Zelle Polyomavirus (MCPyV) ist eine kleine, doppelsträngige DNA-Virus, das eine seltene, aber aggressiver Hautkrebs, Merkel Cell Carcinoma (MCC)1,2zugeordnet wurde. Die Sterblichkeit von MCC, rund 33 % übersteigt die der Melanom-3,4. MCPyV hat eine kreisförmige Genom von ~ 5 kb1,5 geteilt durch eine nicht-kodierenden regulatorischen Region (NCRR) in frühen und späten Codierung Regionen1. Die NCRR enthält die viralen Ursprungs der Replikation (Ori) und bidirektionale Promotoren für virale Transkription6,7. Die frühen Region kodiert Tumor Antigen Proteine genannt großen T (LT), kleine T (sT), 57kT, alternative LT ORF (alt) sowie ein Autoregulatory MiRNA1,8,9,10. Die späten Region kodiert das Kapsid Proteine VP1 und VP211,12,13. LT und sT sind die am besten untersuchten MCPyV Proteine und haben gezeigt, dass die virale DNA-Replikation und MCPyV-induzierten Tumorgenese5unterstützen. Klonale Integration der MCPyV DNA in das Wirtsgenom, die in bis zu 80 % der MCCs beobachtet wurde, ist wahrscheinlich ein ursächlicher Faktor für Virus-positiven Tumor Entwicklung14,15.

Die Inzidenz von MCC hat in den vergangenen zwanzig Jahren16verdreifacht. Asymptomatische MCPyV Infektion ist auch weit verbreitet in der allgemeinen Bevölkerung17,18,19. Mit der zunehmenden Zahl von MCC Diagnosen und die hohe Prävalenz von MCPyV Infektion ist für unser Verständnis des Virus und seine onkogenen Potential zu verbessern. Jedoch bleiben viele Aspekte der MCPyV Biologie und onkogenen Mechanismen schlecht verstandene20. Dies ist vor allem, weil MCPyV repliziert schlecht in etablierten Zelle Linien11,12,21,22,23 und bis vor kurzem Hautzellen unterstützen MCPyV Infektion nicht entdeckten22gewesen. Mechanistische Studien vollständig MCPyV und seine Wechselwirkung mit Wirtszellen zu untersuchen haben durch einen Mangel an Zellkultursystem für die Vermehrung des Virus5behindert.

Wir entdeckten, dass primäre menschliche dermale Fibroblasten (HDFs) von Neugeborenen menschliche Vorhaut Unterstützung robuste MCPyV Infektion sowohl in-vitro isoliert- und ex-Vivo24. Aus dieser Studie haben wir die erste Zelle Kultur Infektionsmodell für MCPyV24. Aufbauend auf diesem Modellsystem, haben wir gezeigt, dass die Induktion von Matrix-Metalloproteinase (MMP)-Gene durch den WNT/β-Catenin Signalisierung Weg und andere Wachstumsfaktoren MCPyV Infektion stimuliert. Darüber hinaus fanden wir, dass die FDA-zugelassenen MEK Antagonist Trametinib effektiv MCPyV Infektion5,25hemmt. Aus diesen Studien haben wir auch eine Reihe von Protokollen für die Isolierung von menschlichen dermalen Fibroblasten24,25, MCPyV Virionen11,12, vorbereiten, durchführen von MCPyV Infektion auf menschlichen dermalen Fibroblasten 24 , 25 und Erkennung von MCPyV Proteine durch IF Färbung26. Darüber hinaus haben wir die in-situ DNA-Hybridisierung Kettenreaktion (HCR) Technologie27 eine hochempfindliche Fisch-Technik (HCR-DNA Fisch) entwickelt zur Erfassung von MCPyV DNA in infizierten menschlichen Hautzellen angepasst. Diese neuen Methoden werden für das Studium des ansteckenden Zyklus der MCPyV als auch die zelluläre Reaktion auf eine MCPyV Infektion nützlich sein. Das natürliche Reservoir Wirtszellen, die MCPyV Infektion beibehalten und die Zellen, die Anlass zu MCC Tumoren bleiben unbekannt. Die Techniken, die wir in dieser Handschrift beschreiben könnte angewendet werden, um verschiedene Arten von menschlichen Zellen, sowohl die Reservoir-Zellen zu identifizieren und Herkunft der MCC Tumoren zu untersuchen. Unsere etablierten Methoden wie HCR-DNA Fisch, konnte auch in der Erkennung von anderen DNA-Tumorviren und Charakterisierung von Host-Zell-Interaktionen eingesetzt werden.

Protocol

Menschlichen Neugeborenen Vorhäute wurden von Penn Skin Disease Research Center erhalten. Erwachsenen menschliche Fibroblasten wurden von ausrangierten normale Haut nach der Operation erhalten. Die Protokolle wurden von der University of Pennsylvania Institutional Review Board genehmigt. 1. Isolierung der menschlichen dermalen Fibroblasten Verwenden Sie eine Schere schneiden Sie Fett und subkutane Gewebe aus der menschlichen Neugeborenen Vorhaut und schneiden die Hautprobe in halbie…

Representative Results

In diesem Manuskript beschriebene Protokoll erlaubt Isolierung von einer nahezu homogenen Bevölkerung von HDFs (Abbildung 1). Wie immunofluorescent Färbung zeigen, fast 100 % der menschlichen Haut Zellen isoliert verwenden, waren die in diesem Protokoll beschriebenen Bedingungen positiv gebeizt für dermalen Fibroblasten Marker Vimentin und Kollagen ich24, aber negativ für den menschlichen Vorhaut Keratinozyten Marker K14 (<strong c…

Discussion

Die Methoden, die oben beschrieben, inklusive Isolation der dermalen Fibroblasten aus menschlicher Hautgewebe, Vorbereitung der rekombinanten MCPyV Virionen, Infektion des kultivierten Zellen, immunofluorescent Färbung und eine empfindliche Fische Methode adaptiert von HCR-Technologie, die sollten Forscher MCPyV Infektion27analysieren können. Einer der kritischsten Schritte zur Erreichung MCPyV Infektion in-vitro-ist die Herstellung von hoch-Titer Virion Zubereitungen. Unter Verwendung des Proto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institut) und Dr. M. Celeste Simon (Universität von Pennsylvania) Danke für die Reagenzien und technische Unterstützung. Wir danken auch die Mitgliedern unserer Labore für hilfreiche Diskussion. Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health (NIH) Stipendien (R01CA187718, R01CA148768 und R01CA142723), das NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) und dem Penn CFAR Award (P30 AI 045008) unterstützt.

Materials

Fetal calf serum HyClone SH30071.03
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X Thermo Fisher Scientific 11140050
GLUTAMAX I, 100X Thermo Fisher Scientific 35050061 L-Glutamine
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190136
0.05% Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 25300-054
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11330-032
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG-200 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Cayman Chemical 13122 Store at -80 degree celsius
CHIR99021 Sigma SML1046 Store at -80 degree celsius
Collagenase type IV Thermo Fisher Scientific 17104019
Dispase II Roche 4942078001
Antibiotic-Antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-062 Protect from light
DMEM medium Thermo Fisher Scientific 11965084
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG Thermo Fisher Scientific A11032 Protect from light
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A11034 Protect from light
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556 Protect from light
Paraformaldehyde Sigma P6148
anti-MCPyV LT (CM2B4) Santa Cruz sc-136172 Lot # B2717
MCV VP1 rabbit Rabbit polyclonal serum #10965 https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
Hygromycin Roche 10843555001
Basic Fibroblast Growth Factors (bFGF), Human Recombinant Corning 354060 Store at -80 degree celsius
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Plasmid-Safe ATP-Dependent DNase EPICENTRE E3101K
Probe hybridization buffer Molecular technologies
Probe wash buffer Molecular technologies
Amplification buffer Molecular technologies
Alexa 594-labeled hairpins Molecular technologies B4 Protect from light
Triton X-100 Sigma X100
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent Thermo Fisher Scientific P7581
BamHI-HF NEB R3136
Buffer PB Qiagen 19066
blue miniprep spin column Qiagen 27104
50mL Conical Centrifuge Tubes Corning 352070
T4 ligase NEB M0202T
MagicMark XP Thermo Fisher Scientific LC5602

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Cite This Article
Liu, W., Krump, N. A., Buck, C. B., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection. J. Vis. Exp. (144), e58950, doi:10.3791/58950 (2019).

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