تحليل الجزئي-تحييد فيروس المخلوي تنفسي (RSV) إنتاجية المحسنة وارتفاع
Summary
تصف هذه الدراسة إنتاجية عالية، المستندة إلى تصوير المقايسة الأبطال الجزئي لتحديد عيار تحييد الأجسام المضادة المحددة للفيروس المخلوي التنفسي (RSV). تم اختبار هذا الشكل مقايسة على أنواع مختلفة من عينة.
Abstract
الجهاز التنفسي المخلوي الخاصة بالفيروس تحييد الأجسام المضادة (RSV رعايتها) علامة هامة للحماية ضد RSV. عدد من تنسيقات مختلفة بالانزيم قيد الاستخدام حاليا في جميع أنحاء العالم حتى لا يكون هناك حاجة لطريقة دقيقة والفائق لقياس رعايتها RSV. يصف لنا هنا مقايسة الأبطال الجزئي على أساس التصوير التي قد تم اختباره على RSV الفريق الفرعي A ويمكن تكييفها أيضا للفريق الفرعي RSV ب وأنواع مختلفة من عينة. هذا الأسلوب الغاية استنساخه، مع اختلافات المقايسة بين الوكالات ل antiserum مرجع حاليا أقل من 10 في المائة. ونحن نعتقد أن هذا التحليل يمكن أن ينشأ سهولة في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم بتكلفة منخفضة نسبيا. تطوير مقايسة محسنة، والفائق الذي يقيس رعايتها RSV يمثل خطوة هامة إلى الأمام لتوحيد هذا الأسلوب دوليا، فضلا عن انتقاده لتقييم المرشحين لقاح RSV الرواية في المستقبل.
Introduction
الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) هو السبب الرئيسي لالتهابات الجهاز التنفسي السفلي في طب الأطفال من السكان في جميع أنحاء العالم1. على الرغم من أن عبء عالية، لا تتوفر لا يزال أي لقاح أو علاج. وقد أعلنت منظمة الصحة العالمية (WHO) منذ عام 2013، تطوير اللقاحات RSV كأولوية رئيسية لبحث، مع اجتماعات التشاور منظمة الصحة العالمية السنوي2،3. ووافقت منظمة الصحة العالمية على استخدام RSV تحييد قياس الأجسام المضادة (NAb) لرصد اللقاحات الاستمناع، هذا هو المعترف بها كعلامة المصلية الرئيسية لحماية4. يعتقل أظهرت لحماية ضد العدوى RSV شديدة في عدد من الدراسات، فضلا عن التجارب السريرية من باليفيزوماب المضادة-RSV [مونوكلونل] جسم، حاليا استراتيجية وقائية فقط المتاحة4.
وهناك عدة صيغ المقايسة قبض تستخدمها المختبرات في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك فحوصات يستند إلى الخلية والجزيئية، التي جعلت جهود توحيد تحدي5،6،،من78. غير أنه ما زال المقايسة الأبطال (PRN) التقليدية للحد من اللوحة أن التدابير عدد البلاك انخفاض تشكيل وحدات (بفو) بوجود جسم RSV-خاصة بمعيار الذهب9. هنا، نحن تقرير بروتوكول PRN المحسنة والمبسطة والفائق التي يمكن استخدامها في العديد من خطوط الخلايا، لسلالات RSV مختلفة ومع المقايسة زيادة الإنتاجية. تم اختبار هذا البروتوكول باستخدام عينات سريرية من إعدادات مختلفة وكذلك على عينات من تجارب حيوانية نموذجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وضعت والأمثل البساطة والكفاءة RSV إبطال الجزئي مقايسة التي يمكن تكييفها مع سهولة في معظم المختبرات. هذا الفحص غير قادرة على قياس قدرة العدوى الفيروسية، فضلا عن قياس تثبيط العدوى الفيروسية بقبض على المستوى الخلوي باستخدام المسح صورة محوسبة. استخدام منصة المستندة إلى تصوير ونظم محددة تس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون جميع المشتركين. نعترف “برنامج دعم البنية التحتية التشغيلية” للحكومة الفيكتوري. PVL مستلم NHMRC زمالة التنمية المهنية.
Materials
| Cell line | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland |
| Viral strains | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | lot number 60430286 |
| Reagents | |||
| Acetone | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sodium salt powder | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Foetal calf Serum (stored in 50ml aliquots at -20 °C) | Interpath | SFBS-F | |
| Goat X RSV antibody | Merck | AB1128 | |
| human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C) | BEI Resources | NR-4022 | Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832) |
| M199 powder | Life Technologies | 31100035 | |
| Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O from Milli-Q dispenser | Merck | In-house dispensation | |
| Sterile 1X PBS for culture (stored at 4°C) | Scientific Services – Tissue Culture | MCRI in house supply | |
| Tween 20 polysorbate | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| General Consumables | |||
| Conical Falcon tubes (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Filter unit 0.22um (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL) | Australia PL | AM12400 | |
| Sterile flat-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 655180 | |
| Sterile U-bottom plates (96-well with lid) | Interpath | 650180 | |
| 5ml serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| 10 mL serological pipette | Interpath | 607180 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| Tip Pipette 100-1000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-L-R-S | |
| Equipments and softwares | |||
| ELISpot reader system | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| AID ELISpot software version 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany | ||
| Microsoft Excel 2007 |
References
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
- Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
- Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
- Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
- Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84 (2005).
- van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253 (2012).
- Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195 (2013).
- Tripp, R. A., Jorquera, P. A. . Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , (2016).
- Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
- Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576 (2014).
- Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).
