이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상
Summary
RNA 바이러스 복제 생산 하는 이중 가닥 RNA는 타고 난 면역 반응 유도 하 패턴 인식 수용 체에 의해 인식할 수 있습니다. 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 낮은 수준의 dsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 불분명 남아 있습니다. Arenavirus dsRNA와 개별 셀에서 PRR를 시각화 하는 confocal 현미경 검사 법 방법을 개발 했습니다.
Abstract
더블-좌초 (ds) RNA는 RNA 바이러스 감염 시 일차 중간으로 생산 됩니다. 호스트 패턴 인식 수용 체 (호흡기) retinoic 산 등으로 dsRNA의 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5) 타고 난 면역 반응의 유도에 이르게. 형성 및 세포내 분포 긍정적인 감 RNA 바이러스 감염에서에서 dsRNA가 되었습니다 잘 특징 현미경 검사 법. 일부 arenaviruses를 포함 하 여 많은 부정적인 감 RNA 바이러스 감염 시 타고 난 면역 반응을 트리거합니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 바이러스 성 dsRNA의 PRR 인식의 이미징 연구를 방해 하는 낮은 수준의 생산으로 생각 되었다. 또한, 감염 실험 높게 병원 성 arenaviruses 높은 견제 biosafety 수준 시설 (BSL-4)에서 수행 되어야 합니다. 높게 병원 성 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA와 호흡기 간의 상호 작용 크게 알려진 연구자 BSL-4 시설에서 직면 하는 추가 기술 도전 때문입니다. 최근, 단일 클론 항 체 (Mab) (클론 9D 5) 원래 팬 엔테로바이러스 감지에 사용 특히 dsRNA 전통적인 J2 또는 K1 안티 dsRNA 항 체 보다 더 높은 감도와 감지 하 발견 되었습니다. 9D 5를 이용 하 여 여기, 항 체, confocal 현미경 검사 법 프로토콜 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR arenavirus에 의해 감염 하는 개별 셀에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된 설명. 프로토콜은 또한 이미징 연구 dsRNA 및 PRR 분포 BSL4 시설에서 감염 하는 병원 성 arenavirus 세포에 적합 합니다.
Introduction
타고 난 면역 반응의 유도의 초기 단계는 더블-좌초 (ds) RNA retinoic 산 등 패턴 인식 수용 체 (호흡기)에 의해 호스트 인식 (장비-나) 수용 체 (RLRs) 의장 처럼-난 및 흑색 종 분화 관련 단백질 5 (MDA-5)1. 긍정적인 감 RNA 바이러스, dsRNA 수 있습니다 일반적으로 쉽게 감지가 J2 또는 K1 안티 dsRNA 단일 클론 항 체 (Mab)2를 사용 하 여. DsRNA와 호흡기 간의 상호 작용 picornavirus, 같은 긍정적인 물가 RNA 바이러스에 confocal 현미경 검사 법3을 사용 하 여 특징 되었습니다 했다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 시각화 및 PRR 및 dsRNA 상호 작용의 특성은 되었습니다 의해 방해 dsRNA에 중요 한 항 체의 부족. RNA 형광 제자리 교 잡 (물고기) 바이러스 성 RNA와 호흡기4의 시각화에 적용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 물고기 방법론 대상 RNA 시퀀스의 지식이 필요 하 고 PRR 공동 얼룩과 호환 되지 않을 수 있습니다. 최근, 9D 5는 원래 팬 엔테로바이러스 감염의 진단에 대 한 개발, Mab 발견 됐다 J2 Mab 보다 더 예민 하 고 쉽게 수 부정적인 감 RNA 바이러스 감염5,6에서 dsRNA를 감지. 따라서, Mab 9D 5 소설과 바이러스 성 복제 및 PRR 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 바이러스 성 RNA의 상호작용 연구에 유용한 도구 이다.
Arenaviruses는 Lassa 바이러스 (LASV), Junín 바이러스 (JUNV)와 Machupo (MACV), 인간7에서 심각한 출혈 질병의 원인이 그 같은 여러 인간 병원 체를 포함 하는 단일 가닥, 부정적인 감 RNA 바이러스의 가족입니다. 임상 데이터로 새로운 세계 arenavirus JUNV에 의해 발생 하는 아르헨티나 출혈의 심각 하 고 치명적인 경우 혈 청 IFN-α8,9의 비정상적으로 높은 수준의 전시. 우리 병원 성 NW arenaviruses (JUNV, MACV), 하지만 하지는 병원 성 올드 월드 arenavirus, LASV, 유도 종류 것으로 나타났습니다 내가 인간 monocyte 파생 된 모 수석 세포10인터페론 (IFN) 응답. 또한, 장비-센서 중 하나입니다 중재 유형 I IFN 응답 JUNV 감염 세포11. 우리는 또한 전통적으로 dsRNA 인식에 대 한 알려져 있다는 단백질 키 니 아 제 R (PKR) 수용 체 병원 성 NW arenavirus 감염12활성화 됩니다 발견. 더 arenavirus 감염 시 바이러스 관련 IFN 응답의 메커니즘을 이해, 우리는 바이러스 성 dsRNA와 세포질 호흡기 간의 상호 작용을 시각화 하기 위해 프로토콜을 개발 목적.
병원 성 JUNV, MACV 및 LASV 감염 실험 biosafety에서 수행 되어야 하는 레벨 4 (BSL-4) 시설. 따라서, 뿐만 아니라 arenavirus 감염에 dsRNA의 아마도 낮은 수준 biosafety 요구 사항을 충족입니다 다른 기술 도전이 높게 병원 성 바이러스에 대 한 이미징 연구를 수행할 때. 9D 5를 이용 하 여 항 체와 JUNV의 Candid1 # 백신 긴장, confocal 현미경 검사 법 기반 프로토콜은 dsRNA, 바이러스 성 단백질 및 PRR에 arenavirus에 의해 감염 된 세포에 동시에 시각화를 성공적으로 사용 된이 보고서에 설명 BSL2 실험실입니다. 프로토콜 또한 세포내의 분포 dsRNA와 PRR BSL4 시설에서 병원 성 arenavirus 감염 시의 시각화를 위해 적당 하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
긍정적인 감 RNA 바이러스 및 dsDNA 바이러스, dsRNA J2 안티 dsRNA 널리 사용 항 체로 쉽게 검색 됩니다. 그러나, 부정적인 감 RNA 바이러스는 dsRNA 동일한 항 체2를 사용 하 여 감지 수준 이하로 낮은 생산 하는으로 추정 된다. 따라서, 바이러스 성 RNA 및 PRR 상호 작용의 여러 측면 크게 부정적인 감 RNA 바이러스에 대 한 명확 하지 않다. 우리는 dsRNA J2 항 체를 사용 하 여 arenavirus 감염에 대 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 UTMB 이미징 핵심 시설과 Maxim Ivannikov 현미경 지원에 감사 하 고 싶습니다.
이 작품은 공중 보건 서비스에 의해 지원 되었다 RO1AI093445 및 RO1AI129198 및 수 여에 SP, UTMB 지 펀드 P84373 채널, T32 AI007526 그들을 부여.
Materials
| APEX Alexa Fluor 647 antibody labeling kit | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | 1:1,000 dilution |
| Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | 1:2,000 dilution; Lot #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Glass microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Goat-anti mouse Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | 1:2000 dilution; Lot #: 1874804 |
| Human lung epithelial A549 cells | ATCC | CCL-185 | |
| Methanol | Fisher | A412 | Stored at -20 °C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugated to Alexa-647 at 1:1,000 dilution |
| Mouse MAb pan-Enterovirus 9D5 Reagent | Millipore Sigma | 3361 | ready for use; diluted to 1:2; Lot #: 3067445 |
| PBS supplemented with Ca and Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Coated coverslips | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 dilution; Lot #: GR97758-7 |
| recombiant Candid#1 strain of JUNV | Lab generated | Lab generated | As previously described in reference 13. |
| RIG-I mouse MAb conjugated to Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | 1:1000 dilution; Lot #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
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