Nachahmung und Manipulation von pankreatischen Acinar-duktale Metaplasie im 3-dimensionalen Zellkultur
Summary
Primäre acinar Zelle isoliert, Protein-Expression oder Aktivität-Modulation, Kultur und Downstream-Anwendungen eignen sich reichlich in der Ex Vivo Studie des acinar-duktale Metaplasie (ADM), einem frühen Ereignis in der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Abstract
Die Differenzierung der acinar Zellen duktale Zellen bei Pankreatitis und in der frühen Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs ist ein Schlüsselprozess, die weitere Untersuchung erfordert. Um die Mechanismen zu verstehen bietet regulierende acinar-duktale Metaplasie (ADM), ex-Vivo-3D-Kultur und Differenzierung der primären acinar Zellen zu Duktuszellen viele Vorteile gegenüber anderen Systemen. Mit der Technik hierin ist die Modulation der Proteinexpression einfach und schnell, erfordert nur einen Tag zu isolieren, zu stimulieren oder Viral infizieren und Kultivierung der primäre acinar Zellen untersuchen die ADM-Prozess zu beginnen. Im Gegensatz zu mit Basalmembran Matrix, die Aussaat des acinar Zellcluster im Kollagen ich extrazellulären Matrix ermöglicht acinar Zellen behalten ihre acinar Identität vor Manipulation. Dies ist wichtig, beim Testen des Beitrags der verschiedenen Komponenten zur Induktion von ADM. Nicht nur sind die Effekte der Zytokine oder andere ectopically verabreichten Faktoren testbar durch diese Technik, sondern der Beitrag der gemeinsamen Mutationen, erhöhte Protein-Expression oder Knockdown von Protein-Expression ist überprüfbar über virale Infektion der primäre acinar Zellen, mit adenoviralen oder Lentivirale Vektoren. Darüber hinaus können Zellen von Kollagen oder Basalmembran Matrix am Endpunkt wieder isoliert und analysiert werden für Protein-Expression.
Introduction
Acinar-duktale Metaplasie (ADM) ist ein Schutzmechanismus bei Pankreatitis und ein Schlüsselprozess fahren Bauchspeicheldrüsenkrebs Entwicklung1 , das weitere mechanistische Einblicke erfordert. Während Entzündung induziert ADM reversibel2, Onkogene KRAS -Mutationen, die in 90 % der Bauchspeicheldrüsenkrebs Fällen3vorhanden sind, zu verhindern, dass Differenzierung zurück zu einer acinar Phänotyp4,5, 6. Culturing und Differenzierung der primäre acinar Zellen in duktale Zellen in 3D Culture ermöglicht die Untersuchung der molekularen Mechanismen zur Regulierung des ADM-Prozess, der schwierig ist, in-vivo Studie. Diese ex-Vivo-Studien ermöglichen Echtzeit-Visualisierung von ADM, seine Fahrer und ihre Aufsichtsbehörden. Mehrere Fahrer der ADM-Prozess sowie die mechanistische Einblicke auf ihre nachgeschaltete Signalwege identifiziert wurden oder verifiziert mit der hier beschriebenen Methode. Dazu gehören ADM Induktion durch TGF-α (transformierende Wachstumsfaktor Alpha)-vermittelten Expression von MMP-7 (Matrix Metalloproteinase-7) und Aktivierung des Notch-7sowie RANTES (reguliert auf Aktivierung, normale T-Zelle ausgedrückt und abgesondert; auch bekannt als Chemokin Liganden 5 oder CCL5) und TNF (Tumor-Nekrose-Faktor Alpha)-induzierte ADM durch Aktivierung von NF-κB (nuclear Factor-κB)8. Ein zusätzliche Vermittler der ADM ist Onkogene KRas9,10, die einen Anstieg der oxidativen Stress verursacht, das erhöht den ADM-Prozess durch erhöhte Expression von EGFR (Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor) und seinen Liganden, EGF ( epidermalen Wachstumsfaktor) und TGF-α-11.
Während der Nutzung der pankreatischen Krebszelllinien für in-vitro-Studien üblich, bieten primären Zellkulturen viele Vorteile. Zum Beispiel sind primäre acinar Zellen von nicht-transgenen Mäusen oder Mäuse beherbergen initiierende Mutationen, wie KrasG12D, das am besten geeignete Modell für das Studium der frühen Veranstaltung von ADM, weil die Zellen verfügen über nur wenige und kontrollierte Mutationen, die sind dafür bekannt, bereits während der Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs vorhanden sein. Dies steht im Gegensatz zu vielen pankreatischer Krebs-Zelllinien, die mehrere Mutationen haben und abwechslungsreich Ausdruck basiert auf Durchgang Nummer12. Darüber hinaus wurden die Signalwege identifiziert mit solchen Mitteln von tierexperimentellen Studien überprüft. Eine Einschränkung der Verwendung von primärer acinar Zellen ist, dass sie wie typische Krebszelllinien transfiziert werden können nicht.
Die Methode hierin beschreibt die Techniken der acinar Zelle isoliert, 3D Culture, die ADM imitiert, indem Stimulanzien oder Modulation der Proteinexpression durch adenoviralen oder Lentivirale Infektion sowie erneute Isolation von Zellen am Endpunkt für weitere Analysen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die relativ kurze Zeitspanne für Isolation, Infektion und Plattieren primäre acinar Zellen ist ein Vorteil dieser Methode. Im Gegensatz dazu Kultivierung acinar Zellen aus einem modellabhängigen Auswuchs erfordert wenig Arbeitsaufwand beträgt, aber es dauert sieben Tage für Auswuchs von acinar Zellen13. Ein alternatives Protokoll für acinar Isolierung14 weist eine sehr kurze Methode zur Erlangung acinar Zellen; EGF ist jedoch ein wesentlicher Bestandteil in lebendig a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen R01 Grant (CA200572) von der NIH, PS. unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Cancer Institute oder den nationalen Instituten Health.The Förderer keine Rolle in hatte studieren, Design, Datenerhebung und -Analyse, Entscheidung veröffentlichen, oder die Zubereitung des Manuskripts.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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