흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작
Summary
주 포상 세포 격리, 단백질 식 또는 활동 변조, 문화, 및 다운 스트림 응용 프로그램은 전에 다량 유용한 vivo 연구 포상-ductal metaplasia (ADM), 췌장암의 개발에는 초기 이벤트.
Abstract
동안 췌 장 염 및 췌장암의 초기 개발에 ductal 세포 포상 세포의 분화 추가 연구를 필요로 하는 핵심 과정 이다. 메커니즘을 이해 하기 ex vivo 3D 문화 그리고 ductal 세포 주 포상 세포의 분화 조절 포상-ductal metaplasia (ADM), 다른 시스템에 비해 많은 장점을 제공 합니다. 본 기술로, 단백질 식의 변조는 간단 하 고 신속 하 게, 분리, 자극 또는 virally 감염 및 ADM 과정 조사를 기본 포상 세포 배양 시작만 1 일 요구. 뿌리기 콜라겐에서 포상 세포 클러스터 나 기질, 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 달리 조작 하기 전에 포상 그들의 정체성을 유지 하기 위해 포상 셀 수 있습니다. 이 때 중요 한 해군 제 독의 유도에 다양 한 부품의 기여를 테스트 뿐만 아니라이 기술을 통해 쓸만한 cytokines 또는 다른 ectopically 관리 요인의 효과 하지만 일반적인 돌연변이, 증가 단백질 표정, 또는 단백질 식의 최저 기여의 바이러스 감염을 통해 쓸만한 주요 포상 세포, adenoviral 또는 lentiviral 벡터를 사용 하 여. 또한, 셀 콜라겐 또는 끝점에서 지하실 멤브레인 매트릭스에서 다시 고립 될 수 있다 고 단백질 식에 대 한 분석.
Introduction
포상-ductal metaplasia (ADM)는 췌 장 염과 췌장암 개발1 기계 통찰력 더 필요한 운전 키 프로세스 동안 보호 메커니즘입니다. 염증 유발 ADM은 가역2, 종양 KRA 돌연변이, 췌장암의 경우3의 90%에 존재는 하는 동안 방지 한 포상 형4,5, 등을 맞댄 차별화 6. Culturing와 3D 문화에 ductal 세포로 기본 포상 세포 차별화 vivo에서 공부 하기가 ADM 과정을 규제 하는 분자 메커니즘의 연구에 대 한 수 있습니다. Ex vivo 연구 같은 ADM, 드라이버와 그 레 귤 레이 터의 실시간 시각화 가능 ADM 과정 뿐만 아니라 그들의 다운스트림 신호 경로에 기계적 통찰력의 몇 가지 드라이버 확인 되었습니다 또는 메서드를 설명 하는 여기를 사용 하 여 확인 된. ADM 유도 TGF-α (변형 성장 인자 알파)에 의해 포함 됩니다-MMP-7 (매트릭스 metalloproteinase-7) 라는 표현과 활성화 노치7, RANTES (활성화, 정상적인 T 세포와 분 비; 또한 알려진 표현에 통제의 중재 chemokine ligand 5 또는 CCL5) 및 TNFα (종양 괴 사 인자 알파)-NF-κB (핵 요인-κB)8의 활성화를 통해 ADM을 유도. ADM의 추가 중재자 종양 Kra9,10, EGFR (표 피 성장 인자 수용 체)의 증가 표현을 통해 ADM 프로세스와 ligands, EGF (향상 된 산화 스트레스에서 증가 일으키는 원인이 되는 표 피 성장 인자)와 TGF-α11.
췌장암 세포 라인의 사용은 체 외 연구에 대 한 일반적인, 1 차 셀 문화는 많은 이점을 제공 합니다. 예를 들어, 비-유전자 변형 쥐 또는 쥐 KraG12D와 같은 시작 돌연변이, 은닉에서 기본 포상 세포는 ADM의 초기 이벤트 셀 몇 및 제어 돌연변이 때문에 공부에 대 한 가장 적절 한 모델을 췌장암 개발 초기에 알려져 있습니다. 이것은 반대로 여러 돌연변이 많은 췌장암 세포 라인 식 통로 번호12에 따라 다양 하 고. 또한, 이러한 방법으로 식별 신호 경로 동물 연구에 의해 확인 되었습니다. 주 포상 세포를 사용 하 여 한 경고는 일반적인 암 세포 선 할 수 있는 그들은 페 수 수 없습니다.
여기 방법 포상 세포 격리, 각성제를 추가 하거나 adenoviral 또는 lentiviral 감염 뿐만 아니라 다시 격리 추가 분석에 대 한 끝점에서 세포의 단백질 발현을 조절 하 여 ADM을 3D 문화의 기법을 자세히 설명 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
격리, 감염, 그리고 기본 포상 세포 도금에 대 한 시간의 상대적으로 짧은 시간이이 방법의 장점이 다. 반면, explant 파생물에서 포상 세포 배양 실습 시간이 좀 필요 하지만 포상 세포13의 파생물에 대 한 일 걸립니다. 포상 격리14 에 대 한 대체 프로토콜 노트 포상 세포;을 얻기 위해 매우 짧은 방법 그러나, EGF 살려 포상 세포 해당 프로토콜을 사용 하 여 격리 하?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품 추 하는 NIH에서 R01 보조금 (CA200572)에 의해 지원 되었다 내용과 전적으로 저자의 책임은 반드시 국립 암 연구소의 공식 견해를 대표 하지 않는다 또는 funders에 역할을 했다 Health.The의 국가 학회 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
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