محاكاة والتلاعب في البنكرياس حؤول Acinar للأقنية في ثقافة الخلية 3 الأبعاد
Summary
عزل خلية acinar الأساسي والبروتين التحوير التعبير أو النشاط، الثقافة وتطبيقات تيار أسفل مفيدة تماما في السابق دراسة فيفو حؤول acinar للأقنية (ADM)، حدث مبكرا في الإصابة بسرطان البنكرياس.
Abstract
التفريق بين الخلايا أسينار إلى خلايا الأقنية خلال التهاب البنكرياس وفي التطور المبكر لسرطان البنكرياس هو عملية رئيسية التي تتطلب مزيدا من الدراسة. لفهم الآليات التي تنظم حؤول acinar للأقنية (ADM)، السابقين فيفو ثقافة 3D وتمايز الخلايا أسينار الأولية لخلايا الأقنية يوفر مزايا عديدة أكثر النظم الأخرى. مع تقنية هنا، تعديل التعبير البروتين بسيطة وسريعة، التي تتطلب يوما واحداً فقط عزل وحفز أو فيروسي يصيب، والبدء في استزراع خلايا أسينار الأولية للتحقيق في عملية ADM. وعلى النقيض من استخدام مصفوفة غشاء الطابق السفلي، بذر مجموعات خلية acinar في الكولاجين أنا المصفوفة خارج الخلية، يسمح أسينار الخلايا الاحتفاظ بهويتهم acinar قبل التلاعب. وهذا أمر حيوي عند اختبار إسهام مختلف مكونات لاستحثاث اﻷدميرال ليس فقط هي آثار السيتوكينات أو غيرها من العوامل التي تدار اكتوبيكالي قابل للاختبار من خلال هذا الأسلوب، ولكن مساهمة مشتركة الطفرات أو تعبير البروتين زيادة أو ضربة قاضية للتعبير البروتين قابل للاختبار عن طريق العدوى الفيروسية الخلايا الأولية أسينار، باستخدام ناقلات أدينوفيرال أو لينتيفيرال. وعلاوة على ذلك، يمكن إعادة عزل من الكولاجين أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي في نقطة النهاية الخلايا وتحليلها للتعبير البروتين.
Introduction
حؤول Acinar للأقنية (ADM) هو إليه وقائية أثناء التهاب البنكرياس وعملية رئيسية يقود التنمية سرطان البنكرياس1 الذي يحتاج إلى مزيد من التبصر آليا. بينما ADM التي يسببها التهاب عكسها2، النمطان كراس الطفرات، التي موجودة في 90% من حالات سرطان البنكرياس3، منع التفريق إلى النمط الظاهري أسينار4،5، 6-كولتورينج والتفريق بين الخلايا أسينار الأولية في خلايا الأقنية في الثقافة 3D يسمح لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم عملية ADM، مما يصعب من الدراسة المجراة في. مثل السابقين فيفو الدراسات تمكن في الوقت الحقيقي التصور ADM وسائقيها والمنظمين لها. تم تحديد العديد من برامج تشغيل عملية ADM، فضلا عن بصيرة آليا على هذه المسارات مما يشير إلى المصب، أو التحقق من استخدام هنا وصف الأسلوب. تشمل هذه ADM التعريفي ب TGF-α (تحويل عامل النمو ألفا)-بوساطة التعبير عن نظام التمثيل التناسبي المختلط-7 (مصفوفة أية-7) والتنشيط من الدرجة7، فضلا عن رنتيس (ينظم في التنشيط، الخلية تي العادية وأعرب ويفرز؛ أيضا معروفة كما يجند chemokine 5 أو CCL5) و TNFα (عامل نخر الورم ألفا)-التي يسببها ADM من خلال تفعيل NF-κB (النووية عامل-κB)8. وسيط إضافي ل ADM هي النمطان كراس9،10، مما يسبب ارتفاعا في الأكسدة التي تعزز عملية ADM من خلال زيادة التعبير عن EGFR (مستقبلات عامل نمو البشرة) ويغاندس، ولو ( عامل نمو البشرة) و TGF-α11.
وفي حين يشيع استخدام خطوط خلايا سرطان البنكرياس للدراسات في المختبر، الثقافات الخلية الابتدائية تقدم العديد من المزايا. على سبيل المثال، خلايا acinar الأولية من الفئران غير المعدلة وراثيا أو الفئران إيواء الطفرات المبادر، مثل كراسG12D، هي النموذج الأنسب لدراسة هذا الحدث بداية من ADM لأن الخلايا الطفرات القليلة والخاضعة للرقابة، التي من المعروف أن يكون حاضرا في بداية التنمية سرطان البنكرياس. هذا على النقيض من ذلك أن العديد من خطوط خلايا سرطان البنكرياس التي لديها طفرات متعددة ويختلف التعبير استناداً إلى الممر رقم12. بالإضافة إلى ذلك، تم التحقق من مسارات الإشارات المحددة بهذه الوسائل من الدراسات الحيوانية. أحد المحاذير من استخدام الخلايا acinar الأولية أنهم لا ترانسفيكتيد خطوط خلايا السرطان نموذجية يمكن.
الطريقة الواردة هنا تفاصيل تقنيات خلية أسينار العزلة والثقافة 3D الذي يحاكي ADM بإضافة المنشطات أو تحوير التعبير البروتين عن طريق العدوى أدينوفيرال أو لينتيفيرال، فضلا عن إعادة عزل الخلايا في نقطة النهاية لمزيد من التحليلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقدار الوقت للعزلة والعدوى، وطلاء الخلايا acinar الأولية قصيرة نسبيا ميزة لهذا الأسلوب. وفي المقابل، استزراع الخلايا أسينار من ثمرة explant تتطلب القليل من الوقت العملي، ولكن يستغرق سبعة أيام لثمرة الخلايا أسينار13. بروتوكولا بديلة لعزل acinar14 تلاحظ أسلوب قصيرة جداً للح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها منحة R01 (CA200572) من المعاهد الوطنية للصحة إلى س. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو الممولين لم يكن لها دور في “المعاهد الوطنية أجرت” دراسة تصميم وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو إعداد المخطوطة.
Materials
| 37 °C shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE4000-7 | |
| 5% CO2, 37 °C Incubator | NUAIRE | NU-5500 | |
| 50 ml tubes | Falcon | 352070 | |
| Absorbent pad, 20" x 24" | Fisherbrand | 1420662 | |
| Adenovirus, Ad-GFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Aluminum foil | Fisherbrand | 01-213-101 | |
| BD Precision Glide Needle 21G x 1/2 | Fisher Scientific | 305167 | Use as pins for dissection |
| Beaker, 600 mL | Fisherbrand | FB-101-600 | |
| Bleach, 8.25% | Clorox | 31009 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Referred to as 'basement membrane matrix recovery solution' in the manuscript. |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R Centrifuge | |
| Collagenase Type I, Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | Create a 100 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water. When thawing one aliquot, dilute to 10 mg/ml, filter sterilize and place 1 ml aliquots at -20 °C. |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Create a 4 mg/ml solution by dissolving powder in methanol, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Ethanol, 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926-100mL | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91127-12 | |
| Glass slide, 8-well | Lab-Tek | 177402 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), No calcium, No magnesium, No phenol red | Fisher Scientific | SH3048801 | |
| Ice bucket, rectangular | Fisher Scientific | 07-210-103 | |
| Instant Sealing Sterilization Pouch | Fisherbrand | 01-812-51 | |
| LAB GUARD specimen bags (for mouse after dissection) | Minigrip | SBL2X69S | |
| Lentiviral Packaging Mix, Virapower | Invitrogen | 44-2050 | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Referred to as 'basement membrane matrix' in the manuscript. |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Referred to as 'plastic paraffin film' in the manuscript. |
| PBS | Fisher Scientific | SH30028.02 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Pipet tips, 10 µl | USA Scientific | 1110-3700 | |
| Pipet tips, 1000 µl | Olympus Plastics | 24-165RL | |
| Pipet tips, 200 µl | USA Scientific | 1111-1700 | |
| Pipet-Aid | Drummond | ||
| PIPETMAN Classic P10, 1-10 μl | Gilson | F144802 | |
| PIPETMAN Classic P1000, 200-1000 μl | Gilson | F123602 | |
| PIPETMAN Classic P20, 2-20 μl | Gilson | F123600 | |
| PIPETMAN Classic P200, 20-200 μl | Gilson | F123601 | |
| Pipettes, 10 ml | Falcon | 357551 | |
| Pipettes, 25 ml | Falcon | 357525 | |
| Pipettes, 5 ml | Falcon | 357543 | |
| Plate, 12-well | Corning Costar | 3513 | |
| Plate, 24-well plate | Corning Costar | 3524 | |
| Plate, 35 mm | Falcon | 353001 | |
| Plate, 6-well | Falcon | 353046 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | Create a 40 mg/ml solution by dissolving powder in sterile molecular biology grade water, aliquoting and storing at -20 °C. |
| Polypropylene Mesh, 105 µm | Spectrum Labs | 146436 | |
| Polypropylene Mesh, 500 µm | Spectrum Labs | 146418 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14568-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 8 | Gibco | 17075029 | |
| Spatula | Fisherbrand | 21-401-10 | |
| Steriflip 50 ml, 0.22 micron filters | Millipore | SCGP00525 | |
| TGF-α | R&D Systems | 239-A-100 | |
| Type I Rat Tail Collagen | Corning | 354236 | |
| Waymouth MB 752/1 Medium (powder) | Sigma | W1625-10X1L | |
| Weigh boat, hexagonal, medium | Fisherbrand | 02-202-101 |
References
- Rooman, I., Real, F. X. Pancreatic ductal adenocarcinoma and acinar cells: a matter of differentiation and development. Gut. 61 (3), 449-458 (2012).
- Stanger, B. Z., Hebrok, M. Control of cell identity in pancreas development and regeneration. Gastroenterology. 144 (6), 1170-1179 (2013).
- Caldas, C., Kern, S. E. K-ras mutation and pancreatic adenocarcinoma. International Journal of Pancreatology. 18 (1), 1-6 (1995).
- Kopp, J. L., et al. Identification of Sox9-dependent acinar-to-ductal reprogramming as the principal mechanism for initiation of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer Cell. 22 (6), 737-750 (2012).
- Morris, J. P. t., Cano, D. A., Sekine, S., Wang, S. C., Hebrok, M. Beta-catenin blocks Kras-dependent reprogramming of acini into pancreatic cancer precursor lesions in mice. Journal of Clinical Investigation. 120 (2), 508-520 (2010).
- Grippo, P. J., Nowlin, P. S., Demeure, M. J., Longnecker, D. S., Sandgren, E. P. Preinvasive pancreatic neoplasia of ductal phenotype induced by acinar cell targeting of mutant Kras in transgenic mice. 癌症研究. 63 (9), 2016-2019 (2003).
- Sawey, E. T., Johnson, J. A., Crawford, H. C. Matrix metalloproteinase 7 controls pancreatic acinar cell transdifferentiation by activating the Notch signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19327-19332 (2007).
- Liou, G. Y., et al. Macrophage-secreted cytokines drive pancreatic acinar-to-ductal metaplasia through NF-kappaB and MMPs. Journal of Cell Biology. 202 (3), 563-577 (2013).
- De La, O. J., et al. Notch and Kras reprogram pancreatic acinar cells to ductal intraepithelial neoplasia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18907-18912 (2008).
- Habbe, N., et al. Spontaneous induction of murine pancreatic intraepithelial neoplasia (mPanIN) by acinar cell targeting of oncogenic Kras in adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18913-18918 (2008).
- Liou, G. Y., et al. Mutant KRas-Induced Mitochondrial Oxidative Stress in Acinar Cells Upregulates EGFR Signaling to Drive Formation of Pancreatic Precancerous Lesions. Cell Report. 14 (10), 2325-2336 (2016).
- Hughes, P., Marshall, D., Reid, Y., Parkes, H., Gelber, C. The costs of using unauthenticated, over-passaged cell lines: how much more data do we need. Biotechniques. 43 (5), 577-578 (2007).
- Blauer, M., Nordback, I., Sand, J., Laukkarinen, J. A novel explant outgrowth culture model for mouse pancreatic acinar cells with long-term maintenance of secretory phenotype. European Journal of Cell Biology. 90 (12), 1052-1060 (2011).
- Gout, J., et al. Isolation and culture of mouse primary pancreatic acinar cells. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Current Protocols in Cell Biology. , 11-20 (2010).
- Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the cytoskeletal organization of invasive cancer cells in 3D. Journal of Visualized Experiments. (80), e50763 (2013).
