إعداد نموذج للإعلام-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات تحليل ميكروفيسيلس العين
Summary
توصيف البروتين من أسرة microvascular العين أمر حيوي لفهم متعمق للعديد من أمراض العين في البشر. وتوضح هذه الدراسة طريقة فعالة وسريعة وقوية لاستخراج البروتين وإعداد عينة من الأوعية الدموية الصغيرة التي توظف الشرايين الهدبية الخلفية قصيرة الخنزير كسفن النموذجي لتحليلات الجماهيري-قياس الطيف الكتلي المستندة البروتيوميات.
Abstract
استخدام معزولة من الأوعية الدموية العين في المختبر فك الدولة الفيزيولوجية المرضية للعين باستخدام النهج التكنولوجية المتقدمة اتسع اتساعاً كبيرا فهمنا لبعض الأمراض. الطيف الكتلي (مللي ثانية)-برز البروتيوميات أساس كأداة قوية لكشف التغيرات في الآليات الجزيئية والبروتين مما يشير إلى مسارات في الأسرة بالأوعية الدموية في الصحة والمرض. نموذج إعداد الخطوات قبل تحاليل مرض التصلب العصبي المتعدد غير حاسمة للحصول على النتائج استنساخه وتوضيح متعمقة للبروتين المعقدة. هذا مهم خاصة لإعداد ميكروفيسيلس العين، حيث كمية العينة المتاحة لتحليلات محدودة في كثير من الأحيان وهكذا، يشكل تحديا لاستخراج البروتين المثلى. هذه المقالة تسعى لتوفير بروتوكولا فعالة وسريعة وقوية لإعداد عينة من مثالية خلف المقلة العين الأوعية الدموية سرير توظيف الشرايين الهدبية الخلفية قصيرة الخنزير. ويركز هذا الأسلوب على إجراءات استخراج البروتين من المادة طافية وبيليه من العينة بعد تجانس، عينة التنظيف باستخدام أجهزة الطرد المركزي عامل التصفية قبل تنقية التفريد والببتيد هلام أحادي البعد الخطوات للقياس الكمي خالية من التسمية في نظام MS تاين خطية فخ أيون-أوربيتراب اليكتروسبراي لوني سائل. على الرغم من أن هذا الأسلوب قد وضعت خصيصا لتحليلات البروتيوميات ميكروفيسيلس العين، كما قدمنا أدلة مقنعة على أن فإنه يمكن أيضا سهولة استخدام العينات الأخرى المستندة إلى الأنسجة.
Introduction
النهوض في الميدان البروتيوميات، أي تصاريح متكاملة وغير مسبوقة من السلطة جمع البيانات، وإلى حد كبير ثورة فهمنا للآليات الجزيئية الكامنة وراء بعض ظروف المرض، وكذلك كما هو الحال في ما يعكس الدولة الفسيولوجية لخلية معينة السكان أو الأنسجة1،2،،من34. البروتيوميات أثبت أيضا أن تكون منبرا هاما في أبحاث العيون نظراً لحساسية وغير متحيزة تحليل العينات العين المختلفة التي تيسر تحديد علامات المرض المحتملة للتشخيص، والتشخيص في نهاية المطاف يدل على أناقة بالعديد من الدراسات في السنوات الأخيرة، بما في ذلك بعض من خاصتي1،5،6،،من78،،من910. ومع ذلك، غالباً ما يصعب الحصول على العينات البشرية لتحليل البروتين نظراً لأسباب أخلاقية، خاصة بالنظر إلى الحاجة إلى مواد مراقبة من الأشخاص الأصحاء للتحليلات المقارنة يمكن الاعتماد عليها. من ناحية أخرى، كما أنها تمثل تحديا للحصول على كمية كافية من عينات لتحليلات جماعية والمطيافيه الأمثل وموثوق بها. هذا أمر بالغ الأهمية لا سيما للمواد البيولوجية المحدودة الجماهيري مثل الأوعية الدموية الدقيقة للعين. واحد هذه الرئيسية خلف المقلة الأوعية الدموية التي تضطلع بدور محوري في تنظيم تدفق الدم العين هو شريان الهدبية الخلفية قصيرة (sPCA). قد يؤدي أي اضطراب أو الحالات الشاذة في هذا السرير الأوعية الدموية في الانعكاسات السريرية الشديدة، التي يمكن أن تؤدي إلى الآلية المرضية للعديد من الأمراض التي تهدد البصر مثل الزرق ونونارتيريتيك الأعصاب البصرية الدماغية الأمامية (NAION)11 , 12-ومع ذلك، هناك نقص الدراسات توضيح التغييرات البروتين في هذا السرير الشرياني بسبب العيوب المذكورة أعلاه. ولذلك، في السنوات الأخيرة، الخنازير البيت (مستأنسةالبري Sus لينيوس، 1758) برز كنموذج حيوان جيدة في أبحاث العيون نظراً لأوجه التشابه مورفولوجك والنشوء والتطور عالية بين البشر والخنازير13، ،من 1415. عينات العين الخنزير متاحة بسهولة، والأهم من ذلك، يتم تمثيل أكثر دقة للأنسجة البشرية.
ونظرا للدور الهام لهذه الأوعية الدموية في العين، فضلا عن ندرة منهجية تهتم لاستخراج البروتين الفعال والتحليلات من هذه ميكروفيسيلس، نحن تميزت سابقا البروتين sPCA الخنزيري الداخل باستخدام بروتوكول التي أسفرت عن تحديد هوية عدد كبير من البروتينات16. وبناء على هذه الدراسة، لدينا كذلك الأمثل ووصف متعمق منهجيتنا في هذا المقال، الذي يسمح تحليل البروتين من المبالغ الدقيقة للعينات باستخدام sPCA الخنزير كنموذج الأنسجة. أن كان الهدف الرئيسي من هذه الدراسة وضع منهجية متوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد للأوعية الدموية العين وسائل محدودة، قدمنا أدلة تجريبية كبيرة أن وصف سير العمل يمكن أيضا تطبيقها على نطاق واسع لعينات مختلفة تستند إلى الأنسجة.
ومن المتوقع أن يقوم سير العمل هذا سوف تكون مفيدة لإعداد عالي الجودة المتوافقة مع مرض التصلب العصبي المتعدد عينات من كميات صغيرة من المواد لإجراء تحاليل شاملة من البروتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
التنميط البروتين شاملة لمجموعة متنوعة من عينات العين خطوة أولى هامة ولا غنى عنها لتوضيح الآليات الجزيئية ومسارات مما يشير إلى تورط في الصحة والمرض. من أجل الحصول على بيانات عالية الجودة، وضمان إمكانية تكرار نتائج للنتائج التي تم الحصول عليها من هذه التحليلات، خطوات إعداد العينة السابقة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم الدكتور مانيكام “الداخلية جامعة أبحاث التمويل” (1 ستوف) من “المركز الطبي الجامعي” في “يوهانس جوتنبرج جامعة ماينز” ومنحة من الأوقيانوغرافية ألماني (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
