眼微血管床的蛋白质组表征对于深入理解人类多种眼病具有重要意义。本研究展示了一种高效、快速且稳健的方法，用于从小血管中提取蛋白质并进行样品制备，以开展基于质谱的蛋白质组学分析，采用猪短后睫状动脉作为模型血管。
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本文内容
摘要
摘要
利用体外分离的眼部血管，结合先进的技术手段来解析眼部的病理生理状态，极大地加深了我们对某些疾病的认识。基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为揭示健康与疾病状态下血管床中分子机制及蛋白质信号通路变化的有力工具。然而，在质谱分析前的样品制备步骤对于获得可重复的结果以及深入解析复杂的蛋白质组至关重要。这对于眼部微血管样品的制备尤为重要，因为可用于分析的样品量通常十分有限，从而给高效的蛋白质提取带来了挑战。本文旨在提供一种高效、快速且稳健的样品制备方案，以猪短后睫状动脉为代表的眶后眼部血管床为示例材料。本方法重点包括组织匀浆后从样品上清和沉淀中提取蛋白质的操作，使用离心滤膜装置进行样品净化，随后进行一维凝胶电泳及肽段纯化步骤，最终实现液相色谱-电喷雾电离-线性离子阱-Orbitrap质谱系统中的非标记定量分析。尽管该方法是专为眼部微血管的蛋白质组学分析而开发，但我们亦提供了充分证据表明，该方法亦可便捷地应用于其他基于组织的样品。
引言
蛋白质组学领域的进步使得整合且无与伦比的数据采集能力成为可能，极大地革新了我们对某些疾病状态下分子机制的理解，同时也反映了特定细胞群体或组织的生理状态1,2,3,4。由于其对不同类型眼部样本具有高灵敏度和无偏倚的分析能力，蛋白质组学已被证明是眼科研究中的一个重要平台，有助于识别潜在的疾病标志物，从而实现最终的诊断与预后评估；近年来许多研究（包括我们的一些研究）已对此提供了有力证据1,5,6,7,8,9,10。然而，由于伦理原因，通常难以获取用于蛋白质组学分析的人体样本，尤其是在需要来自健康个体的对照材料以进行可靠比较分析的情况下。另一方面，获得足量样本以进行最佳且可靠的质谱分析也具有挑战性。这对于眼内微小血管等生物样本....
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方案
所有使用动物样本的实验操作均严格遵循眼科与视觉研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明以及机构指南。本研究在美因茨大学医学中心眼科系进行，并获得批准。
注意：猪眼连同视神经和眼外组织在动物宰杀后立即从当地屠宰场新鲜获取。摘除的眼球置于冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS）中运送到实验室，并立即使用。所采用工作流程的示意图如图1所示。
1. 溶液
- 配制 Krebs-Henseleit (K-H) 缓冲液时，将以下化学试剂称量至一个干燥洁净的 50 mL 锥形离心管中：27.68 g NaCl、8.4 g NaHCO3、1.4 g KCl、1.18 g MgSO4 和 0.64 g KH2PO4；另取一管加入 1.47 g CaCl2 和 8.0 g 葡萄糖。
注意：这些化学试剂的粉末混合物应储存在阴凉干燥处。CaCl2 与葡萄糖的粉末混合物建议现配，以防止吸潮结块。 - 为每份沉淀样品配制 200 µL 提取缓冲液 2A，需将 100 µL 提取缓冲液 2 与 100 µL 跨膜蛋白提取试剂盒中的试剂 A 混....
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结果
样本获取受限是眼科研究中的主要难题之一。相应地，如何从视网膜血管等微量样本中获得最佳蛋白质得率，其提取方法常存在争议。迄今为止，专门针对球后血管蛋白提取的方法仍十分匮乏。因此，作为方法优化的第一步，并为了验证一种相对较新的试剂T-PER与几种常用蛋白提取去垢剂在提取效率和稳健性方面的差异，我们首先利用小鼠心脏组织开展了预实验（因心脏组织易于获取且样本量充足，适合优化步骤）。我们通过比较以下试剂提取后的总蛋白浓度及鉴定到的总蛋白数量，评估其蛋白得率：T-PER、0.02% n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）、1% 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸（CHAPS）、1% 氨基磺基甜菜碱-14（ASB-14），以及乙腈与三氟乙酸的混合液（20% ACN / 1% TFA）。使用上述每种去垢剂提取的样本中总蛋白含量如图6A所示，其中T-PER提取组织的蛋白得率最高（56.4 µg/mg组织），其次为DDM（22.88 µg/mg组织）、CHAPS（16.01 µg/mg.......
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讨论
对多种眼部样本进行全面的蛋白质组分析，是阐明健康与疾病状态下相关分子机制和信号通路的重要且不可或缺的第一步。为了获得高质量的数据并确保这些分析结果的可重复性，前期的样品制备步骤至关重要。Mandal 等人的一篇综述详细讨论了利用二维凝胶电泳和质谱策略对眼球不同部位进行样本处理的流程1，突显了这一点。在此类研究的基础上，本研究提供了一种优化的、逐步操作的实验方案，以猪的视网膜小动脉（sPCA）作为模型眼微血管，实现快速、稳健且高度高效的质谱兼容样品制备。本研究的开展源于目前缺乏特异性方法，难以从数量有限的动脉样本中提取足量蛋白质以生成高质量的质谱数据。本方法也旨在为现有微尺度技术的应用知识体系做出贡献，此类技术可实现优异的蛋白质组图谱绘制18。
在定量蛋白质组分析的实验方案中，有几个关键方面需要考虑，以确保最佳的实验效果。首先，无论样品量多少，都必须进行充分的均质化处理，以保证蛋白质的最佳提取效果。在本研究的方法中，使用不同尺寸的珠子混合物并结合子弹式匀浆仪，对实现组织的完全裂解起到了关键.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Manicam 博士获得了约翰内斯·古腾堡大学美因茨大学医学中心校内大学研究基金（Stufe 1）以及德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号 MA 8006/1-1）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| A. 化学品 | |||
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| 二水合氯化钙（CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| 杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| 甲酸（CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| 高效液相色谱级乙腈（ACN，C2H3N） | AppliChem | A1605 | |
| 高效液相色谱级甲醇（CH3OH） | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| 高效液相色谱级水 | AppliChem | A1589 | |
| 碘乙酰胺（IAA） | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| 氯化钾（KCl） | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| 液相色谱-质谱级乙酸 | Carl Roth | AE69.1 | |
| 硫酸镁（MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE 抗氧化剂 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE 样品还原剂 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 预染蛋白标准品 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V5111 | |
| 氯化钠（NaCl） | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| 碳酸氢钠（NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| 三氟乙酸（TFA， C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)-一水葡萄糖 | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. 试剂与试剂盒 | |||
| 0.5 mm 氧化锆珠 | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0 mm 氧化锆珠 | Next Advance | ZROB10 | |
| 胶体蓝染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | 每盒可染色 25 块小型凝胶 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tri 凝胶 | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm，10 孔 |
| 派斯生物二喹啉酸（BCA）蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract 跨膜蛋白提取试剂盒（TM-PEK） | Merck Millipore | 71772-3 | 每盒 20 次反应 |
| 组织蛋白提取试剂（T-PER） | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. 工具 | |||
| 96 孔 V 型底板 | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96 孔平底板 | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| 一次性切片刀片 | pfm Medical | 207500014 | |
| 一次性手术刀 #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| 解剖针 | Carl Roth | PK47.1 | |
| 超精细 Bonn 剪刀 | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon 圆锥形离心管（50 mL） | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo 剪刀，坚韧型 | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| 精密镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | 5 型 |
| 精密镊子，直头超细尖端 | Carl Roth | LH53.1 | 5 型 |
| 微孔板自粘密封膜 | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| 标准型持针钳 | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| 学生型 Vannas 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas 囊膜切开剪刀 | Geuder | 19760 | 直头，77 mm |
| ZipTipC18 吸头 | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. 仪器与设备 | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 色谱柱 | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 预柱 | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K 离心过滤装置 | Merck Millipore | UFC500396 | 每包 96 个 |
| 分析天平 | Sartorius | H51 | |
| 自动进样器 | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf 浓缩仪，型号 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf 微型离心机，型号 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | 非制冷型 |
| Heraeus Primo R 离心机 | Thermo Scientific | 75005440 | 制冷型 |
| Labsonic M 超声波均质器 | Sartorius | BBI-8535027 | |
| 液相色谱-质谱泵，Rheos Allegro 型号 | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL 质谱仪 | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent 微孔板读板仪 | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| 带涡旋功能的旋转器 | neoLab | 7-0045 | |
| 钛探针（Ø 0.5 mm，长 80 mm） | Sartorius | BBI-8535612 | |
| 超声波清洗器，RK 31 型 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
参考文献
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down....
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