Пробоподготовки для анализа на основе масс спектрометрии Proteomics глазной микрососудов
Summary
Характеристика протеома глазной микрососудистой кровати имеет решающее значение для глубокого понимания многих глазной патологии в организме человека. Это исследование показывает, эффективный, быстрый и надежный метод для извлечения белков и подготовки проб из мелких кровеносных сосудов, используя свинину короткие задней цилиарной артерии как модель судов для масс спектрометрии основе протеомики анализов.
Abstract
Использование изолированной глазной кровеносных сосудов в пробирке расшифровать патофизиологических состояние глаз, используя передовые технологические подходы значительно расширил наше понимание некоторых заболеваний. Масс-спектрометрия (МС)-на основе протеомики стала мощным инструментом, чтобы разгадать изменения в молекулярных механизмов и белка, сигнальные пути в сосудистой кровати в здоровье и болезни. Однако решающее значение для получения воспроизводимых результатов и углубленного разъяснения сложных протеома шаги подготовки образца до MS анализы. Это особенно важно для приготовления глазных микрососудов, где количество образцов, доступных для анализа часто ограничено и таким образом, представляет собой вызов для оптимального белка добычу. Эта статья стремится обеспечить эффективный, быстрый и надежный протокол для пробоподготовки от образцового ретробульбарная глазной сосудистого русла, используя свинину короткие задней цилиарной артерии. Настоящий метод фокусируется на процедур извлечения белков от супернатант и Пелле образца после гомогенизации, образец очистки с центробежным фильтром устройства до очистки электрофореза и пептида одномерный гель шаги для количественного определения свободной этикетки в системе MS ионизации линейной ионной ловушки Орбитрэп жидкость хроматографии электроспрей. Хотя этот метод был разработан специально для протеомики анализов глазной микрососудов, мы также предоставили убедительные доказательства того, что он может также легко применяться для других образцов ткани.
Introduction
Улучшения в области протеомики, какие разрешения интегрированы и непревзойденную мощность сбора данных, значительно изменила наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе определенных условий болезни, а также как отражающие физиологического состояния определенной ячейке населения или ткани1,2,3,4. Протеомика также оказалась важной платформой в офтальмологических исследований из-за чувствительности и объективного анализа различных глазных образцов, которые способствовали выявлению потенциальных болезней маркеров для окончательного диагноза и прогноза, как подтверждается элегантно многих исследований в последние годы, в том числе некоторые из наших1,5,6,,78,9,10. Однако часто трудно получить человека образцы для протеомных анализов этическим причинам, особенно учитывая необходимость контроля материалов от здоровых лиц для надежной сравнительного анализа. С другой стороны это также сложно получить достаточное количество образцов для оптимального и надежный масс-спектрометрических анализа. Это особенно важно для массы ограниченной биологических материалов, таких как микро кровеносных сосудов глаза. Один из таких крупных ретробульбарная кровеносных сосудов, что играет ключевую роль в регуляции глазной кровотока является короткий задний цилиарной артерии (sPCA). Любое возмущений или аномалии в этом сосудистого русла может привести к тяжелой клинические последствия, которые могут привести к патогенезу несколько прицел опасных заболеваний, таких как глаукома и nonarteritic передней ишемической оптической невропатии (NAION)11 , 12. Однако, есть отсутствие исследований, изучение протеома изменения в этом артериальной постели из-за вышеупомянутых недостатков. Таким образом в последние годы, дом свиньи (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) стала хорошей модели на животных, в офтальмологических исследований благодаря высокой морфологических и филогенетических сходства между люди и свиньи в13, 14,15. Свинину глазной образцы легко доступны, и самое главное, более точное представление о тканях человека.
Учитывая важную роль этих кровеносных сосудов в глаз, а также нехватка методологии, удовлетворяются за эффективным белка извлечения и анализа от этих микрососудов мы ранее характеризовались протеома свинину sPCA, с использованием собственного Протокол, что привело к идентификации большое количество белков16. На основе этого исследования, мы далее оптимизированный и описал углубленного Наша методология в этой статье, которая позволяет протеома анализ от мизерных количествах образцов, используя свинину sPCA как модель ткани. Хотя основной целью данного исследования было установить MS-совместимых методологии для масс ограниченной глазной кровеносных сосудов, мы обеспечили существенные экспериментальные доказательства того, что описывается рабочий процесс может широко применяется также для различных образцов ткани.
Предполагается, что этот процесс будет способствовать для подготовки образцов MS-совместимых высокого качества от небольших количествах материалов для анализа всеобъемлющих протеома.
Protocol
Representative Results
Discussion
Всеобъемлющие протеома профилирование различных глазных образцов является важным и необходимым первым шагом для выяснения молекулярных механизмов и сигнальных путей, замешанных в здоровье и болезни. Для того, чтобы получить высокое качество данных и обеспечить воспроизводимость ре?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Д-р Manicam поддерживается внутренним университета финансирование исследований (Stufe 1) из медицинского центра Университета Йоханнеса Гутенберга Университета Майнца и Грант от Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).
Materials
| A. Chemicals | |||
| 1, 4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 1.11474 | |
| Ammonium bicarbonate (ABC, CH₅NO₃) | Sigma-Aldrich | 5.33005 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth | 5239.1 | 2.5 mM |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190169 | |
| Formic acid (CH2O2) | AppliChem | A0748 | |
| HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N) | AppliChem | A1605 | |
| HPLC-grade methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | M/4056/17 | |
| HPLC-grade water | AppliChem | A1589 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth | 6781.1 | 4.7 mM |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth | 3904.2 | 1.2 mM |
| LC-MS-grade acetic acid | Carl Roth | AE69.1 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth | 261.2 | 1.2 mM |
| NuPAGE Antioxidant | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0005 | |
| NuPAGE LDS Sample buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0007 | 4x |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Sample reducing agent | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0004 | 10x |
| SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC5925 | |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 9265.2 | 118.3 mM |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth | 965.3 | 25 mM |
| Trifluoroacetic acid (TFA, C2HF3O2) | Merck Millipore | 108178 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth | 6780.1 | 11 mM |
| B. Reagents and Kits | |||
| 0.5mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB05 | |
| 1.0mm zirconium oxide beads | Next Advance | ZROB10 | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | LC6025 | To stain 25 mini gels per kit |
| NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | NP0321BOX | 1.0 mm, 10-well |
| Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK | Merck Millipore | 71772-3 | 20 reactions per kit |
| Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) | Thermo Scientific | 78510 | |
| C. Tools | |||
| 96-well V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651180 | |
| Corning 96-well flat-bottom plates | Sigma-Aldrich | CLS3595-50EA | |
| Disposable microtome blades | pfm Medical | 207500014 | |
| Disposable scalpels #21 | pfm Medical | 200130021 | |
| Dissection pins | Carl Roth | PK47.1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Falcon conical centrifuge tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mayo scissors, Tough cut | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Precision tweezers | Fine Science Tools | 11251-10 | Type 5 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth | LH53.1 | Type 5 |
| Self-adhesive sealing films for microplates | Ratiolab (vWR) | RATI6018412 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Student Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | Straight, 77 mm |
| ZipTipC18 pipette tips | Merck Millipore | ZTC18S096 | |
| D. Equipment and devices | |||
| 150 × 0.5 mm BioBasic C18 column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-150565 | |
| 30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column | Thermo Scientific, Rockford, USA | 72105-030515 | |
| Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices | Merck Millipore | UFC500396 | Pack of 96. |
| Analytical balance | Sartorius | H51 | |
| Autosampler | CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland | HTS Pal | |
| BBY24M Bullet Blender Storm | Next Advance | NA-BB-25 | |
| Eppendorf concentrator, model 5301 | Sigma-Aldrich | Z368172 | |
| Eppendorf microcentrifuge, model 5424 | Fisher Scientific | 05-403-93 | Non-refrigerated |
| Heraeus Primo R Centrifuge | Thermo Scientific | 75005440 | Refrigerated |
| Labsonic M Ultrasonic homogenizer | Sartorius | BBI-8535027 | |
| LC-MS pump, model Rheos Allegro | Thermo Scientific, Rockford, USA | 22080 | |
| LTQ Orbitrap XL mass spectrometer | Thermo Scientific, Bremen, Germany | ||
| Multiskan Ascent plate reader | Thermo Labsystems | v2.6 | |
| Rotator with vortex | neoLab | 7-0045 | |
| Titanium probe (Ø 0.5mm, 80mm long) | Sartorius | BBI-8535612 | |
| Ultrasonic bath, type RK 31 | Bandelin | 329 | |
| Xcell Surelock Mini Cell | Life Technologies | El0001 |
References
- Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
- Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
- Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
- Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
- Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526 (2018).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
- Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629 (2016).
- Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
- Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481 (2017).
- Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
- Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
- Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
- Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
- Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
- Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298 (2016).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
- Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
- Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
- Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111 (2011).
- de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
- Cottingham, K. 1DE proves its worth… again. Journal of Proteome Research. 9, 1636 (2010).
