Aqui nós apresentamos um protocolo para a combinação de duas técnicas de processamento de amostra, de alta pressão congelamento e processamento de amostra assistida por microondas, seguido por resina mínima incorporação para a aquisição de dados com um íon focalizado feixe microscópio eletrônico (FIB-SEM). Isso é demonstrado usando uma amostra do nervo tibial de rato e Caenorhabditis elegans.
A técnica de preparação de amostra descrita é projetada para combinar a melhor qualidade de preservação ultra-estruturais com o contraste mais adequado para a modalidade de imagem em um íon focalizado feixe microscópio eletrônico de varredura (FIB-SEM), que é usado para obter pilhas de imagens sequenciais de reconstrução 3D e modelagem. De alta pressão frio (HPF) permite perto de preservação estrutural nativa, mas congela a subsequente substituição muitas vezes não oferece contraste suficiente, especialmente para uma amostra maior, que é necessária para a imagem latente de alta qualidade na SEM necessária para 3D reconstrução. Portanto, neste protocolo, após a substituição de congelamento, etapas adicionais contrastantes são realizadas à temperatura ambiente. Embora essas etapas são executadas em um microondas, também é possível acompanhar o processamento de banco tradicional, que exige mais tempo tempos de incubação. A subsequente incorporação em quantidades mínimas de resina permite mais rápido e mais preciso direcionamento e preparação dentro o FIB-SEM. Este protocolo é especialmente útil para amostras que exigem a preparação de congelamento de alta pressão para uma preservação ultraestrutural confiável mas não ganho de contraste suficiente durante a substituição de congelamento para a imagem latente de volume usando o FIB-SEM. Em combinação com a incorporação de resina mínima, este protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente para a aquisição de dados de volume de alta qualidade.
Congelamento de alta pressão é o método de preparação de amostra de escolha para a obtenção de preservação ultraestrutural de alta qualidade, que representa o estado nativo de uma amostra muito melhor do que os métodos de preparo convencional utilizando fixação química1. Este método de cryo-preparação é útil para amostras como rato mielinizadas tecido2 e uma exigência rigorosa para uso do organismo modelo elegans de Caenorhabditis3. Depois da substituição de congelamento e incorporação de resina, estas amostras são geralmente analisadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ou tomografia de elétrons (ET). Se volumes maiores devem ser fotografadas usando FIB-SEM ou imagem de rosto-bloco serial para reconstruções 3D em grande escala de alta resolução, em nossa experiência a imagem apropriada por SEM muitas vezes é dificultada pela falta de contraste. No FIB-SEM, a imagem é geralmente gravada por detecção de elétrons retroespalhados do feixe primário. O rendimento de elétrons retroespalhados é proporcional ao conteúdo de metais pesados na amostra. Portanto, protocolos foram projetados especialmente para o volume de imagens para realçar o contraste por impregnação adicional de heavy metal. Tais métodos são baseados em amostras quimicamente fixas e aplicam uma combinação de tetróxido de ósmio tetróxido de ósmio-thiocarbohydrazide4, conforme descrito por Knott et al.5, para o bloco serial-rosto e focada feixe de íons, microscopia eletrônica. Modificações, incluindo o uso de formamida e pirogalol6 ou chumbo aspartato7 foram aplicadas com sucesso para diferentes técnicas de imagem.
O protocolo fornecido aqui combina o cryo-preparação de amostras por HPF e congelar a substituição com subsequente assistida por microondas para maior contraste usando o tetróxido de ósmio/thiocarbohydrazide em acetona à temperatura de processamento. Demonstramos isso sobre o tibial nervus mielinizadas de ratos e em Caenorhabditis elegans, que representam amostras que necessitam de alta pressão, congelamento por preservação ultraestrutural de alta qualidade. Além disso, é mostrado como, após a desidratação e infiltração, as amostras são incorporadas com como pouco resina quanto possível. Esta resina mínima incorporação8 permite a segmentação mais rápido da estrutura de interesse e reduz o tempo gasto no processamento da amostra, incluindo menos tempo necessário para expor a região de interesse com o feixe de íons. Depois de realizar mais etapas de preparação de amostra dentro do microscópio, imaging e moagem da amostra é realizado continuamente para adquirir uma pilha de imagens. Para visualização 3D, software (IMOD) de processamento de imagem é usada para reconstruir partes do conjunto de dados.
Nosso fluxo de trabalho descreve como o contraste mais adequado de amostras para a imagem latente de volume pode ser combinado com a melhor preservação ultraestrutural por substituição HPF e congelar. Isso é útil para amostras que requerem estritamente cryo-preparação. Aplicativos são limitados a pequenas amostras que podem ser preparadas por HPF. Em amostras de diferentes naturezas, tais como materiais vegetais ou microrganismos, este protocolo requer adaptação.
O protocolo foi desenvolvido para ilustrar a óptima preservação e contraste para realizar a imagem de bloco-rosto serial com um FIB-SEM. Portanto, optamos por aplicar cryo-imobilização seguido por pós-coloração usando substituição de congelamento e processamento assistida por microondas. Portanto, este protocolo é limitado para amostras que são pequenas o suficiente para o congelamento de alta pressão. As limitações de tamanho de 3 a 6 mm de largura e espessura de ~ 200 µm são estabelecidas pelo tamanho do porta-amostra, que coincide com o tamanho de amostra que pode ser devidamente congelado com esta técnica. Isto é relevante para a amostra de nervos de rato, desde que o nervo ciático é muito grande em diâmetro para se encaixar as operadoras de 0,2 mm que são necessários para assegurar o congelamento adequado. Portanto, recomenda-se a dissecção cuidadosa de um nervo menor como o nervo tibial ou outro nervo fino como o nervo femoral. Desde que a bainha de mielina é sensível ao alongamento, grande deve ter cuidado durante a dissecção do nervo fresco e viável para evitar a manipulação de artefatos. Em geral, apenas viáveis amostras devem ser usadas para estudos microscópicos de elétron.
Assistida por microondas processamento e incorporação de resina mínima são projetados para acelerar a preparação e orientação de processo. O processamento assistida por microondas, aplicando um protocolo modificado o OTO4 é usado para fixação química de temperatura. Um microondas doméstico não irá produzir os mesmos resultados, uma vez que não há nenhuma distribuição homogénea das microondas, sua temperatura não é controlada e não há nenhum vácuo que pode ser aplicado. O menor, por exemplo, a melhor penetração dos produtos químicos; Portanto, os melhores resultados são alcançados por amostras menores. Para evitar danos à amostra por superaquecimento, controle de temperatura e aplicação a minimamente necessária potência do microondas são críticos. As etapas de processamento assistida por microondas podem ser executadas no banco se não houver nenhum microondas disponíveis, que levarão a mais longos tempos de processamento. Para estruturas de destino diretamente no SEM, é crucial remover resina tanto quanto possível do topo da amostra. Após a gravação de um conjunto de dados, pós-processamento dos dados brutos é necessário reduzir o tamanho do arquivo e melhorar a relação sinal-ruído. Técnicas de imagem moderna volume produzem grandes quantidades de dados. Portanto, para executar o processamento de dados de forma rápida e suficiente, RAM suficiente na estação de trabalho é necessário. Para operações de alinhamento pelo menos duas vezes mais RAM como o tamanho do conjunto de dados é necessário.
Este protocolo foi testado sobre o nervo tibial do mouse, bem como em c. elegans. Hall et al.. 12 usado um passo semelhante de realce após sua substituição de congelamento no banco para a preparação de c. elegans. Para qualquer outro organismo modelo tais como o peixe-zebra, ajustes do protocolo são provavelmente necessária. Uma modificação possível é mudar a composição do coquetel, tais como congelar substituição pela adição de água que é usada para realce de contraste18. Além disso, a duração da substituição congelamento deve ser adaptada à amostra e pode ser reduzida consideravelmente de acordo com a substituição de congelamento rápido protocolo19. Uma possibilidade é a aplicação de agitação para acelerar a substituição de congelar processo20. Após a substituição de congelamento, mais modificações são possíveis, tais como a aplicação repetida de melhorar produtos químicos e tetróxido de ósmio21. Durante o processamento de microondas, a temperatura, tempos de incubação e as configurações de energia podem ser variadas para otimizar os resultados para a respectiva amostra.
Este protocolo mostra que tal um aprimoramento pode ser combinado com outros protocolos de substituição de congelamento e diferentes tipos de amostras conforme descrito por Hall12 que são fotografadas em um FIB-SEM ou por microscopia eletrônica serial bloco-rosto. Estas técnicas de imagem exigem maior contraste, que é menos importante para microscopia eletrônica de transmissão.
The authors have nothing to disclose.
A FIB-SEM e A.S. (posição do operador FIB-SEM) são financiados pelo Cluster de excelência e microscopia de escala nanométrica de centro de pesquisa Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) e fisiologia Molecular do cérebro (CNMPB). Agradecemos ao laboratório de Thomas Müller-Reichert pelo fornecimento das amostras de c. elegans . Agradecemos Ulrich Weikert para participar no filme.
Instrumentation | |||
Leica HPM100 | Leica | ||
Automatic Freeze Substitution | Leica | ||
Laboratory microwave with temperature control unit | Ted Pella | ||
EM ACE600 with gold target | Leica | ||
Crossbeam 540 | Zeiss | ||
Halogen lamp 12 V/ 20 W | Osram | ||
Oven | VWR | ||
Freezing | |||
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
M9 | Homemade | According to C. Elegans- A practical approach I.A.Hope | |
Hexadecene | Sigma-Aldrich | 52276 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | P2307 | |
A type carrier | Wohlwend GmbH | #241 | |
B type carrier | Wohlwend GmbH | #242 | |
Slit carrier | Wohlwend GmbH | #446 | |
Plastic Pasteur pipettes | VWR | 612-1684 | |
Forceps | FST | 11200-10 | |
Freeze substitution | |||
Acetone | science services | 10015 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
Osmium tetroxide | EMS | 19100 | |
Uranyl acetate | SPI-Chem | 02624-AB | |
Acetone | EMS | 10015 | |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich | 223220 | |
Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7884-450EA | |
Watch glass dishes, 150 mm | VWR | 216-2189H | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich | 44610 | |
Mounting | |||
SEM stubs | Science Services | E75200 | |
Aclar | Science Services | 50425-10 | |
Toothpicks | |||
filter paper | VWR | 512-3618 | |
conductive silver resin | EMS | 12670-EE | EPO-TEK EE 129-4 |
Software | |||
Image acquisition | Zeiss | SmartSEM | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas5 A3D | |
Image processing | Open source | Fiji | http://fiji.sc/#download |
Image visualization | Open source | IMOD | http://bio3d.colorado.edu/imod/ |