מודל ממשק מוח-דם אנושי ללמוד מכשול המעברים על ידי פתוגנים או תרופות והאינטראקציה שלהם עם המוח
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר את ההגדרה של cellulo ב BBB (מחסום הדם-מוח)-Minibrain פוליאסטר נקבובי ממברנה תרבות להוסיף מערכת על מנת להעריך את התחבורה של מולקולות או מדבקים BBB האנושית שלהם ההשפעה הפיזיולוגית על תאי המוח שכנות.
Abstract
בתחילת ההקרנה של תרופות במערכת העצבים רלוונטי, אמין במודל BBB cellulo עבור חדירה שלהם והאינטראקציה שלהם עם מכשול ההפרדה לבין parenchyma המוח עדיין צורך. כדי למלא את הפער הזה, תיכננו 2D במודל cellulo, BBB-Minibrain, על ידי שילוב של פוליאסטר נקבובי ממברנה תרבות הוספה האנושי BBB דגם עם Minibrain נוצר על ידי tri-תרבות של תאי מוח אנושי (הנוירונים, האסטרוציטים ותאים microglial). BBB-Minibrain מאפשרת לנו לבחון את התעבורה של מועמד סמים neuroprotective (למשל, Neurovita), דרך BBB, כדי לקבוע את פילוח מסוים של מולקולה זו את הנוירונים וכדי להראות כי המאפיין neuroprotective של הסם השתמר לאחר התרופה חצה BBB. גם הראו שכל BBB-Minibrain מהווה מודל מעניין כדי לזהות את המעבר של חלקיקי וירוס על פני המכשול תאי אנדותל וכדי לפקח הזיהום של Minibrain על ידי חלקיקי וירוס neuroinvasive. BBB-Minibrain היא מערכת אמין, קל לטפל עבור חוקר מיומן בטכנולוגיית התרבות תאים, חזוי של הפנוטיפים תאי המוח לאחר טיפול או עלבון. הריבית על כך בבדיקת cellulo תהיה כפולה: היכרות עם derisking צעדים מוקדם בהתפתחות סמים מצד אחד וצמצום השימוש מצד ניסויים בבעלי חיים.
Introduction
המוח מופרדת מן הלב מחזור מערכתי במבנה שאינו חדיר המגבילה חילופי בין parenchyma במוח ובדם, קרא את מחסום הדם – מוח (BBB). בעיקר מורכב מוחי תאי אנדותל, BBB באופן דינמי אינטראקציה עם האסטרוציטים, perivascular מיקרוגלייה, הנוירונים parenchyma המוח שכנות. שלושת התפקודים העיקריים של BBB הן היצירה ואת התחזוקה של הומאוסטזיס יוניים פונקציות עצביים, אספקה של המוח עם חומרים מזינים, והגנה מפני פציעות רעילים או ערך של פתוגנים1,2, אשר תורמים שמירה על הומאוסטזיס המוח ו שלה פונקציות3. מחסום זה כל כך יעיל, כי רק מספר תרופות יכולים לחצות את BBB4,5. בזמן הנוכחי, השיטות הזמינות כדי לחזות אם מולקולה לעבור BBB, טשטוש לתוך המוח מורכב ex-vivo מחקרים על הנתיחה גשמי, תמונת מעקב במוח של מתנדבים אנושיים על ידי חיית המחמד (המיקום פליטה או MRI (הדמיית תהודה מגנטית) טומוגרפיה) או pharmacodynamics ומחקרים פרמוקוקינטיים פרה בבעלי חיים-6,–7,–8. מודלים וטכניקות אלה יש מגבלות מסוימות, כגון את הרזולוציה מוגבלת של חיית המחמד ואת הרגישות הנמוכה של6,MRI8, הקושי לכמת מולקולות (קרי, מולקולות הנוגדן מבוסס למשל) זה גרוע לחדור את המוח7, עבור פרה מחקרים שלהם עלות גבוהה, אתר הנופש של הניסויים בחיות.
הנקודה האחרונה חשוב כי, על פי של 3R כללי, (החלפת, הפחתת ועידון של הניסויים בחיות) כמקובל רגולטוריות ביקשו כי החוקרים לפתח בדחיפות חלופה מדעית מדויקת חיה ניסויים9,10,11,12,13,14,15.
בעשורים האחרונים, מספר מודלים במבחנה של BBB הוצעו16,17,18 ע י טיפוח במסנן ממברנה מוסיף תאי אנדותל של מינים שונים כגון עכבר, חולדה, שור, חזיר. מבחינת המין האנושי, הזמינות נדירה וקשה של ראשי תאים תתבקש החוקרים לפתח מודלים אנושי המבוסס על תאי אנדותל מונצחים המוח או בתאי גזע האדם, נגזר19,20, 21. מחסומים אלה הם המחליפים במבחנה נאותה של BBB ובלבד שהן מבטאות תא אנדותל סמנים, סמנים צומת חזק, מסועי בזרימת, נושאות ממס, רצפטורים, מגיבים לגירויים אנדותל 20. מספר דגמים BBB באמצעות סנן ממברנה מוסיף מצופה תאי אנדותל ואת סוגי תאים אחרים (קרי, האסטרוציטים, הנוירונים או pericytes22,23,24) היו לבדיקה. המטרה של תרבויות משנה אלה היה כדי להגדיל את המאפיינים הפיזיים BBB על ידי ניצול של ההפרשה של גורמים מסיסים האסטרוציטים/נוירונים או pericytes.
למרות זאת, אף אחד המודלים האלה כולל המוח parenchyma ללמוד ואף לנבא גורלו של מועמד סמים ברגע זה עבר את המחסום. לכן, המטרה שלנו היא לבנות את cellulo בתוך הדם/מוח ממשק, BBB-Minibrain, על ידי שילוב של מודל BBB ותרבות של תאי המוח מעורב לתוך ערכת יחיד. BBB-Minibrain משתמש במערכת התרבות המורכב מסנן נקבובי מוכנס טוב של צלחת תרבות תא multiwell. המסנן מצופה hCMEC/D3 תאים, קו תא אנדותל המוח האנושי הוכח ואמינים עבור בדיקות26,25,27, כדי ליצור BBB סמים BBB. Minibrain, וזו תרבות משותפת הבדיל של נוירונים אנושיים, האסטרוציטים נגזר28,29 קו תא NTera/Cl2.D1 מעורבבים יחד עם הקו תא microglial האנושי – יחס המקביל30 CHME/Cl5 מיקרוגלייה לעומת נוירון-האסטרוציטים יחסי של המוח31, הוא טיפח בתחתית הצלחת היטב.
מלבד לימוד מעבר של סמים מעבר BBB, גורלם ב- parenchyma, הממשק דם-מוח במודל cellulo יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לפנות את כניסתם של פתוגנים למוח (neuroinvasiveness), הפיזור למוח (neurotropism) הרעילות (neurovirulence) הם יכולים להפעיל על תאי המוח parenchyma. מחקרים Neurovirulence neuroinvasiveness להפיק תועלת פיתוח יעיל במודל cellulo, יתרון להחליף חייתיים. באמצעות את קיט BBB-Minibrain32, להדגים את פנוטיפ neuroinvasive של מוטציות ויראלי נדיר שהצטברו ב צרפתית Neurotropic וירוס מזן נגיף קדחת צהובה (קרי, FNV-YFV33,34) נהגה להכין הופסק תרכיב חי YFV ואת המעבר של biomolecule neuroregenerative, neuroprotective שנקרא Neurovita (כאל NV מעתה ואילך בכתב היד)35. כי NV גם באופן טבעי חוצה את קרום התא ולא BBB, NV היה התמזגו עם החלק המשתנה (VHH) של נוגדן שרשרת אחת לאמה חוצה את הקרומים הביולוגיים כולל BBB והוא מתפקד בתור תא חודר מולקולה (CPM)36. המאפיין CPM של VHH נראה תלויים על נקודה איזואלקטרית ואורך VHH37.
כך במבחן cellulo יהיה ניתן למיין מולקולות פוטנציאלי יכול לחצות BBB לפני ביצוע פרמוקוקינטיים וניתוח pharmacodynamics בבעלי חיים, ובאופן אידיאלי בו זמנית כדי להיות מסוגל לחזות את התנהגותם, עצבנית parenchyma. מערכת זו היא ביולוגית הרלוונטי וקל להפעלה ולשימוש לטפל על ידי אנשי מקצוע מיומן היטב תא תרבות26,29,30,38. הריבית על כך בבדיקת cellulo תהיה כפולה: הפחתת העלויות של בדיקות פרה מצד אחד וצמצום השימוש בחיות מצד.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה להדגים כיצד לבנות את cellulo בתוך הדם/מוח ממשק, BBB-Minibrain, על ידי שילוב של מודל BBB ותרבות של מעורב במוח תאים במוח (Minibrain) לתוך ערכת יחיד. מערכת זו היא ביולוגית רלוונטית, קל להגדיר ולטפל עבור ניסויים מיומן היטב בתרבות התא.
באשר במבחנה מודל אחר של BBB, תוצאות אמינות מתקבלת אם פקד …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים פנימי פסטר כולל של גרנט Incitative (PTR 435) ועל ידי מענק “Contrat דה Soutien à la רשרש” הניתנים על ידי סאנופי פסטר את פסטר. א דה קוסטה נתמך על ידי מענק סאנופי-פסטר פלוריאן Bakoa היא זוכת מענק PhD שסופקו על-ידי ANRT (האגודה נאסיונאל דה לה רשרש et de la Technologie). . אנחנו חבים יחסי ציבור פייר-אוליבייה Couraud, ד ר פלורנס מילר לדיונים מועיל.
Materials
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
- Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
- Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
- Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
- Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
- Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
- Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
- Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
- Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
- Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. 发育生物学. 103 (2), 285-293 (1984).
- Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
- Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
- Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
- da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
- Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , (2014).
- Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
- Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
- Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , (2011).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
- Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
- Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
- Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
- Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).
