Мозг человека кровь интерфейс модель для изучения пересечения барьера патогенов или лекарства и их взаимодействия с мозгом
Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающие настройку в cellulo BBB (гематоэнцефалический барьер)-Minibrain полиэстер пористые мембраны культуры вставить системы для того чтобы оценить перевозки биомолекул или инфекционных агентов через человека BBB и их физиологическое влияние на соседние клетки головного мозга.
Abstract
Раннего скрининга нервной системы лекарственных средств на соответствующие и надежной в cellulo BBB модели для их проникновения и их взаимодействие с барьером и паренхимы мозга все еще неудовлетворенных потребностей. Чтобы заполнить этот пробел, мы разработали 2D в cellulo модели, BBB-Minibrain, комбинируя полиэстер, пористые мембраны культуры Вставка человека BBB модель с Minibrain образованные tri культура клеток мозга человека (нейроны, астроциты и Микроглии клеток). BBB-Minibrain позволила нам для проверки транспорта нейропротекторной наркотиков кандидата (например, Неуровита), через BBB, чтобы определить конкретные ориентации этой молекулы нейронов и показать, что свойство нейропротекторной препарата была сохранена после препарата пересекли BBB. Мы также продемонстрировали, что BBB-Minibrain представляет собой интересную модель обнаружить проход вирусных частиц через барьер эндотелиальных клеток и контролировать инфекцию Minibrain neuroinvasive вирусных частиц. BBB-Minibrain является надежной системы, прост в обращении для исследователя, подготовленных в технологии культуры клеток и прогнозирования фенотипов клетки мозга после лечения или оскорбление. Такой интерес к cellulo тестирования будет двоякой: представляя доходностью шаги в начале разработки лекарственных средств, с одной стороны и сокращения использования животного тестирование с другой стороны.
Introduction
Мозг отделена от кровообращения не проницаемой структуры, которая ограничивает обмены между паренхимы мозга и крови, называемый гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Главным образом состоит из церебральный эндотелиальных клеток, BBB динамически взаимодействует с астроциты, периваскулярной Микроглия и нейроны соседних паренхимы мозга. Три основные функции BBB являются создание и поддержание ионного гомеостаза нейрональных функций, снабжение мозга с питательными веществами и защиты от токсичных травм или вступлению патогенов1,2, которые способствуют поддержание гомеостаза головного мозга и его функции3. Этот барьер является настолько эффективным, что только некоторые препараты могут пересекать BBB4,5. В настоящее время доступные методы прогнозирования ли молекулы будет пройти BBB и диффундируют в мозг состоят из ex vivo исследований на вскрытие материала, изображение слежения в мозге человека добровольцев МРТ (магнитно-резонансная томография) или ПЭТ (координата выбросов томография) или фармакодинамики и фармакокинетические доклинические исследования на животных6,,78. Эти методы и модели имеют некоторые ограничения, такие как ограниченное разрешение PET и низкая чувствительность МРТ6,8, трудно подсчитать молекул (т.е., антитела на основе молекул, например), что плохо проникают в мозг7и для доклинических исследований их высокой стоимости и курорт животных испытаний.
Последний пункт имеет важное значение потому, что, согласно правилам 3R, (замена, сокращение и уточнение животных испытаний) регулирования администраций спросил что исследователи срочно разработать научно обоснованной альтернативы животных эксперименты в9,10,11,12,13,14,15.
За последние десятилетия, несколько моделей в пробирке BBB были предложены16,17,18 , культивируя на фильтр мембраны вставляет эндотелиальных клеток из разных видов, таких как мыши, крысы, крупный рогатый скот и свиньи. Что касается человеческого вида, дефицитных и сложных наличие первичных элементов побудило исследователям развивать человека модели, основанные на эндотелиальных клеток увековечен мозга или стволовых клеток человека производные19,20, 21. Эти барьеры являются надлежащим в пробирке суррогаты BBB, при том условии, что они выражают эндотелиальных клеток маркеры, маркеры жесткой перехода, измеряем транспортеры, вещества перевозчиков, рецепторы и реагировать на эндотелиальных раздражители 20. Несколько моделей BBB, с помощью вставки мембраны фильтра покрытием с эндотелиальных клеток и другие типы клеток (то есть, астроциты, нейроны или pericytes22,23,24) в дубликатах. Цель этих совместно культур было увеличить физические характеристики BBB, воспользовавшись секрецию растворимых факторов астроциты/нейронов или pericytes.
Тем не менее ни одна из этих моделей включает паренхимы мозга для изучения и предсказать судьбу кандидата наркотиков после того, как он прошел барьер. Таким образом, нашей целью было построить в cellulo кровь/мозг интерфейс, BBB-Minibrain, объединяя модель BBB и культуры клеток головного мозга, смешанных в один комплект. BBB-Minibrain использует систему культуры, состоящий из пористых фильтр вставляется в хорошо плиты культуры multiwell клеток. Фильтр покрыта hCMEC/D3 клеток, человеческий мозг эндотелиальных клеток линии, которая оказалась весьма надежным для BBB наркотиков испытания25,26,27, сформировать BBB. Minibrain, которая является совместно дифференцированной культура человека нейронов и астроциты, производный от NTera/Cl2.D1 клеток линии28,29 смешанные вместе с линией клеток человека микроглии ЧМЭ/Cl530 в соответствующий коэффициент Микроглии vs. нейрон астроциты соотношения мозга31, выращивается в нижней части пластины хорошо.
Помимо изучения проход наркотиков через BBB и их судьба в паренхиме, кровоснабжение мозга интерфейс в cellulo модели может быть мощным инструментом для решения вступлению патогенов в мозг (neuroinvasiveness), дисперсия в мозг (neurotropism) и токсичность (нейровирулентности), они могут оказать на клетки паренхимы мозга. Нейровирулентности и neuroinvasiveness исследования будет выгоду от развития эффективного в cellulo модели и целесообразно заменить Животные модели. Используя комплект BBB-Minibrain32, мы продемонстрировали neuroinvasive фенотип редких вирусный мутантов, которые накапливаются в французский нейротропные штамм вируса вируса желтой лихорадки (т.е.,33,ФНВ-YFV34) используется для подготовки прекращено живые YFV вакцины и прохождение neuroregenerative и нейропротекторной биомолекулы, называется Неуровита (именуемая NV отныне в рукописи)35. Потому что NV ни естественно пересекает клеточной мембраны, ни BBB, NV была сливается с переменной части (VHH) из одной цепи антитела ламы, который пересекает биологических мембран, включая BBB и функционирует как ячейки проникающего молекулы (CPM)36. CPM свойство VHH, как представляется, зависит от изоэлектрической точке и длину VHH37.
Это в cellulo тесте должно сделать его можно отсортировать молекулы, которые потенциально могут пересекать BBB до проведения фармакокинетические и фармакодинамика анализа в животных, а в идеале в то же время иметь возможность предсказать их поведение в нервной паренхимы. Эта система является биологически актуальной и легко создать и обработать профессионалами, хорошо подготовленных в ячейку культуры26,,2930,38. Такой интерес к cellulo тестирования будет два раза: сокращение издержек доклинических испытаний с одной стороны и сокращения использования животных испытаний с другой стороны.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы показали, как построить в cellulo кровь/мозг интерфейс, BBB-Minibrain, объединяя модель BBB и культуры смешанных мозга головного мозга клетки (Minibrain) в единый комплект. Эта система является биологически актуальной, легко настроить и обрабатывать для экспериментаторов, хорошо подго?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано за счет внутренних субсидий Пастера, включая Incitative Грант (PTR 435) и гранта «Contrat де поддержки à la Recherche» предоставляемых Санофи Пастер до Пастера. A. да Коста было поддержано Санофи Пастер Грант и Florian Bakoa является получателем PhD субсидии, предоставляемые ANRT (Национальная ассоциация de la Recherche et de la Technologie). Мы в долгу перед Pr Пьер-Оливье Couraud и д-р Флоренс Миллер за полезные дискуссии.
Materials
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
- Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
- Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
- Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
- Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
- Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
- Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
- Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
- Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
- Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. 发育生物学. 103 (2), 285-293 (1984).
- Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
- Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
- Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
- da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
- Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , (2014).
- Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
- Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
- Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , (2011).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
- Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
- Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
- Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
- Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).
