生物技术环境下的氟黏膜化人乳三糖--用基因编码生物传感器分析
Summary
本文介绍了利用全细胞生物传感器对岩藻糖类母乳低聚糖 (Hmo) 进行高通量检测和定量的研究。我们还在这里演示了这个平台的适应, 以分析 HMO 生产菌株, 重点是提高信噪比。
Abstract
母乳低聚糖 (Hmo) 是母乳中复杂的碳水化合物成分, 对婴儿健康有丰富的益处。然而, 由于单糖及其联系的检测和定量吞吐量相对较低, 其生物技术合成的优化受到限制。传统的糖类分析技术包括色谱/质谱法, 每天吞吐量约为数百种, 没有自动化。我们在这里演示了一种基因编码的细菌生物传感器, 用于高通量、链接特异性检测和定量的岩藻酰化 HMO 结构, 2 ‘-岩藻糖乳糖和 3-岩藻淀粉乳糖, 我们通过异源实现岩藻的表达。由于乳糖在牛奶或生物技术过程中的存在可能导致误报, 我们也证明了使用不同的策略来减少乳糖的信号。由于该技术的高吞吐量, 许多反应条件或生物反应器参数可以在几小时内并行检测, 从而优化了 HMO 的制造。
Introduction
母乳低聚糖 (Hmo) 是乳糖衍生的低聚糖, 通常由3至8种糖单体组成。他们有乳糖 (Gal-β1, 4-glc) 减少端, 并进一步拉长糖基链 (Β-1, 3-或β-1, 6-) 到葡萄糖 (Glc), 半乳糖 (Gal), 或 n-乙酰葡萄糖胺 (GlcNAc)。此外, 经常添加岩藻糖 (Fuc, α-1, 2-或α-1, 3-) 或唾液酸 (Sia 或 NeuAc, α-2, 3 或α-2, 6-) 残留物1。
目前对低聚糖和其他碳水化合物的分析在吞吐量和范围上都受到色谱-质谱 (ms) 技术的需要,2,3,4, 5,6,7, 每个样品大约需要一个小时, 更不用说昂贵的设备、专用柱和衍生剂的必要性, 以及对该设备操作的专业知识.低聚糖的联系是特别难以确定, 需要先进的 ms9,10或核磁共振 (nmr)技术 11。因此, 这些低聚糖的合成的快速优化受到这一缓慢分析步骤的吞吐量的限制。
在这项研究中, 我们证明了基于甲丝化三糖乳糖的 Hmo 的联系特异性检测, 重点是 2 ‘-岩藻糖乳糖 (2 ‘-fl), 这是人类牛奶中最丰富的 HMO, 使用基因编码的大肠杆菌整个细胞在 4 mgl 时具有检测极限的生物传感器。这种生物传感器的一个重要特点是它能够区分异构三糖。设计原理是基于在大肠杆菌中分离乳糖的特定岩藻糖酶的表达, hmo 中的乳糖的存在被lac操作数检测到, 进而产生荧光信号。我们通过建立一个双质化系统来实现这一目标, 一个是具有链状岩溶酶的系统, 另一个是荧光报告蛋白。该生物传感器平台适用于流式细胞仪或微板读取器的高通量筛选。我们还演示了生物传感器在量化工程菌株12产生的 2 ‘-fl 中的应用.在这项研究中, 我们还提出了三种策略, 选择性去除乳糖, 这可能会导致来自生物传感器的假阳性信号, 因为工程生产者应变是在乳糖上生长的。
总之, 基因编码的生物传感器使我们能够以特定链接的方式检测和量化 Hmo, 即使使用色谱、MS 或 NMR 技术也很难这样做。由于其高吞吐量和易用性, 该方法应在 Hmo 的代谢工程和合成中得到广泛的应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们提出了一种高通量的策略, 用于检测有豆科乳脂质的母乳低聚糖的链接。这是通过基因工程大肠杆菌构建整个细胞生物传感器来实现的, 在与特定糖类诱导时, 大肠杆菌会以荧光信号做出反应。该协议还详细介绍了如何利用生物传感器检测和量化代谢工程细菌株中的 Hmo。
与色谱质谱方法相比, 我们的协议具有较高的吞吐量, 并具有较高的替代方法优势。低检测极限和…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了爱荷华州立大学创业基金的支持。F. e. 的部分资金来自 NSF Trecect 研究金和 Manley Hoppe 教授职位。T. j. m. 得到了 Karen 和 Denny Vaughn 学院研究金的部分支持。作者感谢爱荷华州立大学流式细胞仪设施和 w. m. Keck 代谢代谢研究实验室在荧光和 LC-MS 研究方面提供的协助。
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
References
- Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
- Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
- Royle, L. Chapter 8 – Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
- Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
- Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
- Evangelista, R. A., Liu, M. -. S., Chen, F. -. T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
- Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
- Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
- Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -. P., Tsai, S. -. T., Ni, C. -. K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562 (2018).
- Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
- Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
- Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
- Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
- Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).
