Analyse des Trisaccharides lait Fucosylées homme dans contexte biotechnologique génétiquement encodé biocapteurs
Summary
Nous décrivons ici la détection haut débit et la quantification des oligosaccharides de lait humain fucosylées (HMO) à l’aide d’un biocapteur à germes entiers. Nous démontrons ici, l’adaptation de cette plate-forme vers l’analyse des souches de production HMO, mettant l’accent sur l’amélioration du rapport signal sur bruit.
Abstract
Le lait humain oligosaccharides (HMO) sont les composants de hydrate de carbone complexe du lait maternel humain qui présentent de nombreux avantages sur la santé infantile. Cependant, l’optimisation de leur synthèse biotechnologique est limitée par le débit relativement faible de détection et de quantification des monosaccharides et des liens. Les techniques classiques d’analyse glycane comprennent des méthodes chromatographiques /-spectrométrie de masse avec le débit de l’ordre de plusieurs centaines d’échantillons par jour sans automation. Nous démontrons ici, un biocapteur bactérien génétiquement codé de haut-débit, assemblage spécifique de détection et de quantification des structures fucosylées HMO, 2′-fucosyllactose et 3-fucosyllactose, qui nous atteint via hétérologue expression de fucosidases. Comme la présence de lactose dans le lait ou dans les procédés biotechnologiques pourrait conduire à de faux positifs, nous démontrons également la réduction du signal du lactose en utilisant des stratégies différentes. En raison du débit élevé de cette technique, beaucoup de conditions de réaction ou de paramètres de bioréacteur pourraient être dosés en parallèle en quelques heures, ce qui permet l’optimisation de la fabrication de HMO.
Introduction
Oligosaccharides de lait maternel (HMO) sont des oligosaccharides dérivé de lactose, généralement composée de trois à huit monomères de sucre. Ils ont une réduction de lactose (Gal-β1, 4-Glc) fin et sont plus allongées par des liaisons glycosidiques (β-1, 3 – ou β-1, 6-) de glucose (Glc), galactose (Gal) ou le N-acétylglucosamine (GlcNAc). En outre, fucose (Fuc, α-1, 2 – ou α-1, 3-) ou l’acide sialique (Sia ou NeuAc, α-2,3 – ou α-2, 6-) résidus sont souvent ajoutés1.
Analyse actuelle des oligosaccharides et des autres glucides est limité en débit et en portée par la nécessité d’une chromatographie/spectrométrie de masse (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, qui peut prendre environ une heure par exemple, pour ne pas mentionner la nécessité d’équipements coûteux, colonnes spécialisées et agents de dérivatisation et expertise sur le fonctionnement de cet équipement8. Liens d’oligosaccharides sont particulièrement difficiles à déterminer, nécessitant des avancées MS9,10 ou de techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN)11. Optimisation rapide de la synthèse de ces oligosaccharides est donc limitée par le débit de cette étape analytique lente.
Dans cette étude, nous démontrons la liaison spécifique détection fucosylées trisaccharide ossi à base de lactose, en se concentrant sur la 2′-fucosyllactose (2′-FL) qui est le plus abondant HMO dans le lait maternel, en utilisant un génétiquement encodé Escherichia coli cellules entières biocapteur avec une limite de détection à 4 mg/L. Une caractéristique importante de ce biocapteur est sa capacité à distinguer les isomères trisaccharides. Le principe de conception est basé sur l’expression des fucosidases spécifiques chez e. coli qui libèrent le lactose de HMO, dont la présence est détectée par l’opéron lac , qui à son tour génère un signal fluorescent. Nous y parviendrons en construisant un système de deux-plasmide, on nourrissait la fucosidase de liaison spécifique et l’autre une protéine fluorescente journaliste. Cette plateforme de biocapteurs est adaptée pour le criblage à haut débit par cytométrie en flux ou micro-lecteur. Nous démontrons également l’utilisation du biocapteur pour quantifier la 2′-FL produite par une souche modifiée12. Dans cette étude, nous présentons trois stratégies sur l’élimination sélective de lactose qui peut entraîner des faux signaux positif depuis le biocapteur, étant donné que la souche producteur machiné est cultivée sur le lactose.
Pris ensemble, les biocapteurs codés génétiquement nous permettent de détecter et quantifier les HMO dans une manière de liaison spécifique, qui est difficile même avec chromatographique, MS ou NMR techniques. En raison de son haut rendement et facilité d’utilisation, cette méthode devrait avoir de nombreuses utilisations dans l’ingénierie métabolique et la synthèse des HMO.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons une stratégie haut-débit pour la détection de liaison spécifique de fucosylées oligosaccharides de lait maternel. Cela a été accompli en construisant des biocapteurs à germes entiers par génie génétique e. coli , qui, après induction par glycanes spécifiques, répondre avec un signal fluorescent. Le protocole détaille également sur comment le biocapteur peut être utilisé pour détecter et quantifier les HMO dans une souche bactérienne métaboliquement modifiée.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l’Iowa State University fonds de démarrage. F.E. a été partiellement financé par la NSF Trinect bourse et Manley Hoppe professorat. T a été partiellement prises en charge par le Karen et Denny Vaughn faculté Fellowship. Les auteurs remercient l’Iowa State University Flow Cytometry Facility et le laboratoire de recherche de métabolomique W.M. Keck d’assistance avec la fluorescence et SM-études.
Materials
| 2’-Fucosyllactose | Carbosynth | 41263-94-9 | |
| 3-Fucosyllactose | Carbosynth | 41312-47-4 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Flow Cytometer | BD | FACSCanto Plus RUO | |
| HPLC | Agilent Technologies | 1100 Series HPLC system | |
| HPLC Column | Luna | C18 reversed phase column | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | 11815024 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Lactose | Fisher Scientific | 64044-51-5 | |
| M9, Minimimal Salts, 5x | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| MS | Agilent Technologies | Mass Selective Trap SL detector | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 13472-35-0 |
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