利用透射式诺马尔斯基型差分干涉对比显微镜对等离激元纳米粒子进行光谱学研究

摘要

本实验方案的目的是详细介绍一种经过验证的方法，用于制备等离激元纳米颗粒样品，并利用微分干涉差显微镜（DIC）对其进行单颗粒光谱分析。

摘要

微分干涉差（DIC）显微镜是一种强大的成像工具，最常用于利用可见光范围对微米级物体进行成像。本实验方案的目的是详细介绍一种经过验证的等离子体纳米颗粒样品制备方法，并结合DIC显微镜对其进行单颗粒光谱分析。为了实现可重复的光谱实验，必须严格遵循若干关键步骤。首先，可在样品基底上刻蚀标记点，以帮助定位样品表面，并在实验过程中追踪目标区域。其次，必须彻底清洁基底上的碎屑和污染物，否则这些杂质可能干扰或遮蔽样品的观察。样品正确制备后，需使用科勒照明（Kohler Illumination）对显微镜的光路进行校准。在使用标准诺马尔斯基（Nomarski）型DIC显微镜时，可能需要旋转样品，特别是当等离子体纳米颗粒表现出取向依赖性光学特性时。由于DIC显微镜具有两个固有的正交偏振场，其波长依赖性的DIC对比图样能够揭示棒状等离子体纳米颗粒的取向。最后，数据采集与数据分析必须谨慎进行。通常可将基于DIC的光谱数据表示为对比度值，但也可将其表示为强度数据。在本单颗粒光谱分析的DIC应用示例中，重点研究球形和棒状金纳米颗粒。

引言

自20世纪80年代以来，微分干涉相差（DIC）显微镜技术在很大程度上被视为生物科学领域内用于微尺度物体成像的重要方法。然而，在20世纪50年代和60年代该技术发展的初期，其设计初衷是作为一种材料科学的研究技术¹。随着近年来等离激元纳米颗粒相关材料科学的进展，利用光学显微镜对材料进行表征的研究兴趣日益增加。

目前已有多种光学技术可用于纳米材料的表征（例如暗场、明场、偏振光、荧光等）。暗场技术在纳米颗粒研究中应用广泛，但它仅依赖散射光的收集，对复杂样品提供的信息有限²。荧光技术可能有用，但仅适用于能够发光或可被适当染色的样品。微分干涉差显微镜（DIC）具备若干特性，使其成为纳米颗粒分析的有力工具。相较于其他方法，尤其是针对等离激元纳米颗粒，DIC最常被提及的优势包括：无需样品染色、无晕轮效应、景深浅以及横向分辨率高³。此外，DIC还具备其他对等离激元纳米颗粒研究具有价值的优点。首先，系统内存在两个固有且正交的偏振场，可同时用于光谱测量²。其次，纳米颗粒的去偏振信号不会被最终图像所捕获²，而这一点在暗场光谱测量中可能引发严重关注。

本文的目的是提供一种利用透射光诺马尔斯基微分干涉相衬（DIC....

方案

1. 使用标准玻璃显微镜载玻片进行样品制备

1. 准备用于样品沉积的玻璃载玻片。
   注意：在某些情况下，将玻璃保存在超纯水中可能比保存在乙醇中更合适。然而，长时间将玻璃保存在水或空气中会使玻璃逐渐变得疏水。
   1. 为获得最佳效果，请购买玻璃或石英显微镜载玻片和盖玻片。
   2. 使用划痕笔在每片盖玻片中心轻轻划出短而浅的标记。
   3. 即使购买的是“预清洁”玻璃，也应对所有显微镜用玻璃进行清洗，以去除玻璃碎屑、灰尘、粉末、有机残留物以及其他可能影响成像质量或样品沉积的污染物。
      注意：以下清洗方法适用于本文所述类型的样品，并避免使用强腐蚀性化学品。强腐蚀性化学品可能腐蚀玻璃，且在操作和处置时需要更加谨慎。
      1. 将显微镜用玻璃放置在储存架上，再放入烧杯或染色缸中。切勿将显微镜用玻璃直接放置在烧杯或其他实验室玻璃器皿底部而不使用支架，因为每一片玻璃的每个表面都应充分暴露于清洗剂中。
      2. 向容器中加入约 1 mL 液体洗涤剂（材料表），然后加水至满。超声处理 30 分钟。
         注意：一旦开始清洗过程，操作玻璃时应始终佩戴手套，以避免在玻璃上留下指纹残留。
      3. 将清洗容器中的液体倒入水槽中。用超纯水多次冲洗容器，直至完全去除洗涤剂残留。重新用超纯水注满容器。将装有显微镜用玻璃的容器再次超声处理 30 分钟。
      4. 至少重复上述步骤一次。....

结果

当处理大到肉眼可见的样品时，通常无需在玻璃基底上标记定位标志。然而，在处理纳米材料或需要确定样品取向的情况下，定位标志可提供一种简便的方法，用于定位、区分和追踪样品的方向。尽管可采用更复杂的技术在玻璃基底上留下标志¹⁷，但使用刻划笔在玻璃表面划痕是一种经济且简单的方法，适用于多种情况。需要注意的是，应避免检测紧邻这些标志的样品区域，因为划痕会产生复杂的背景，可能影响数据结果（图3）。然而，在划痕的末端，常会向外延伸出被称为“蜘蛛网”的细线结构。这些线条作为定位标志非常有价值，但同样地，若纳米颗粒与这些缺陷重叠，则应避免选择这些区域。

为了在微分干涉差显微镜（DIC）成像中获得最佳效果，确定合适的焦平面至关重要。略微失焦的物体会显得模糊、边缘不清，并且对比度降低。图4展示了不同程度失焦的金.......

讨论

使用微分干涉差（DIC）显微镜成像时，在采集数据前优化光学组件至关重要。即使在实验过程中对偏振器进行微小调整，也可能对最终数据产生显著影响⁶。此外，不同样品材料需要不同的偏振器设置。尽管本实验中采用了较大的步长以展示偏振角的影响，但在实际实验中，必须将偏振器的设置在最佳对比度位置的1°–2°范围内进行优化。偏振器的设置角度也应记录下来，以供后续参考。建议始终在交叉偏振器（0°）点的同一侧进行操作。来回切换并无优势，反而可能因阴影图案的反转而导致混淆。

其次，计划进行光谱分析时，监测背景强度至关重要。最佳方法是通过调整相机曝光时间，或在光路中添加中性密度滤光片来实现。调节光圈或光源强度可能会影响柯勒照明，并改变对比度值。背景在样品上的分布应相对均匀，以确保选择不同的背景区域不会影响对比度的计算结果。应避免使用周围没有干净背景区域的样品。此外，背景强度的初始设置既不能过高，也不能过低。若背景强度设置过高，部分信号可能超出相机的最大检测范围，导致这些区域的对比度无法计算；若背景强度设置过低，则难以在微分干涉差（DIC）信号的暗部与背景信号之.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	用于清洁显微镜玻片，可通过多家化学试剂供应商获取
乙醇	Fisher Scientific	A962-4	用于清洁和保存显微镜玻片
玻璃显微镜盖玻片	Ted Pella	260148
玻璃显微镜载玻片	Ted Pella	26007
金纳米棒	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
金纳米球（80 nm）	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	NIH提供的免费数据分析软件
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E 显微镜	Nikon	N/A
氮气	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ 数字 sCMOS 相机	Hamamatsu	77054098
标记笔	Amazon	N/A	网上有多种低于10美元的选择，无需购买昂贵型号。
超纯水			18 兆欧