투과 형 Nomarski 타입 차동 간섭 콘트라스트 현미경을 사용 하 여 플라스 몬 Ic 나노 입자에 대 한 분광학 수행

Summary

이 프로토콜의 목표는 혈장 나노 입자 샘플의 제조를 위한 입증 된 접근법을 상세히 설명 하 고 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용 하 여 단일 입자 분광학을 수행 하는 것입니다.

Abstract

차동 간섭 대비 (DIC) 현미경은 가시 범위 조명을 사용 하 여 마이크로 스케일 오브젝트를 이미징 하는 데 가장 일반적으로 사용 되는 강력한 이미징 도구입니다. 이 프로토콜의 목적은 플라스틱 나노 입자 샘플을 제조 하 고 DIC 현미경으로 단일 입자 분 광 법을 수행 하는 입증 된 방법을 상세히 설명 하는 것입니다. 반복 가능한 분 광 실험을 수행 하기 위해서는 몇 가지 중요 한 단계를 신중 하 게 따라야 합니다. 먼저, 랜드마크는 샘플 기판에 에칭 될 수 있으며,이는 실험 중 관심 영역을 추적 하 고 샘플 표면을 찾는데 도움을 준다. 다음으로, 기판은 샘플의 검사를 방해 하거나 모호 하 게 할 수 있는 이물질 및 오염 물질을 적절히 청소 해야 합니다. 샘플이 제대로 준비 되 면, 현미경의 광학 경로는 Kohler 조명을 사용 하 여 정렬 되어야 합니다. 표준 Nomarski 스타일 DIC 현미경, 샘플의 회전 필요할 수 있습니다., 특히 플라스 몬 ic 나노 입자 방향 의존적 광학 특성을 전시 하는 경우. DIC 현미경은 2 개의 내재 된 직교 분극 필드를가지고 있기 때문에 파장 의존적 DIC 대조 패턴은 막대 모양의 플라스 몬 나노 입자의 방향을 드러냅니다. 마지막으로 데이터 수집 및 데이터 분석을 신중 하 게 수행 해야 합니다. DIC 기반 분광학 데이터를 대조 값으로 표현 하는 것이 일반적 이지만, 강도 데이터로 제시 하는 것도 가능 합니다. 단일 입자 분 광 법에 대 한 DIC의이 데모에서는 구형 및 막대 모양의 금 나노 입자에 초점을 맞추고 있습니다.

Introduction

1980 년대 이후, 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경은 주로 생물학적 과학 내에서 마이크로 스케일 개체를 위해 예약 된 중요 한 이미징 방법으로 간주 되었습니다. 그러나, 1950 년대와 1960 년대에 개발 하는 동안, 그것은 재료 과학¹의 기술로 서 의도 되었다. 최근에는 플라스 몬 나노 입자와 관련 된 재료 과학의 발전과 함께 광학 현미경으로 재료의 특성화에 대 한 관심이 증가 했습니다.

많은 광학 기술은 나노 물질 특성화 (예: 어두운 분야, 명시 야, 편광, 형광 등)에 확실히 사용할 수 있습니다. 다크 필드는 나노 입자 연구에서 널리 사용 되지만 분산의 수집에만 의존 하 고 복잡 한 샘플²에 대 한 제한 된 정보를 제공 합니다. 형광은 유용할 수 있으 나 적절 하 게 염색 될 수 있는 샘플에만 사용 됩니다. DIC 현미경 검사 법은 나노 입자 분석을 위한 유용한 도구를 만드는 몇 가지 특성을가지고 있습니다. 다른 방법에 비해 및 플라즈마 나노 입자에 관해서 DIC의 가장 자주 언급 한 장점은: 아니 샘플 얼룩이 필요, 아무 후광 효과, 필드의 얕은 깊이 및 높은 측면 해상도³. DIC는 플라스 몬 나노 입자 연구에 가치 있는 추가 강점을가지고 있습니다. 우선, 두 개의 내재적 및 직교 분극 필드가 존재 하며 분 광 목적²에 대해 동시에 측정 할 수 있습니다. 둘째로, 나노 입자의 탈 편광 신호는 최종 이미지²에서 포착 되지 않으며,이는 어두운 분야 분광학 측정에서 심각한 우려를 유발할 수 있다.

이 기사의 목적은 투과-빛 Nomarski DIC 현미경 검사 법을 활용 하 여 플라스 몬 나노 입자에 대 한 분광학을 수행 하는 명확한 방법론을 제공 하는 것입니다. DIC는 매우 다양 한 물질에 적용 될 수 있는 강력한 기술 이지만, 나노 입자를 이미징 할 때 적절 하 게 작동 하는 데 큰 기술과 이해가 필요한 기술 이기도 합니다. 전송 기반의 Nomarski DIC 현미경 검사 법은 단지 여기에 간략하게 검토 할 복잡 한 빛 경로¹ 이 있습니다. 그림 1에서 DIC의 광 기차가 표시 됩니다. 광은 먼저 편광자를 통과 하 여 현미경을 투과 하 고 노 마 르 스키 프리즘을 투과 시켜 샘플 평면 상에 응축 기에 의해 초점을 맞추고 있다. 목표를 통과 한 후 빛은 검출기로 나가기 전에 Nomarski 프리즘과 분석기를 결합 하 여 빔을 발견 합니다. 두 개의 편광판과 Nomarski 프리즘은 DIC 이미지의 형성에 중요 하며 DIC의 두 직교 편광 필드 1을 생산 하는^일을 담당 합니다. Nomarski DIC 현미경의 작동 원리 및 광학적 인 경로에 대 한 더 많은 것을 알고에 관심이 있는 독자를 위해, 또는 Nomarski DIC 및 DIC의 다른 스타일의 차이,이 주제에 대 한 다른 잘 작성 된 계정을 참조 하십시오^{1, 4 , 5 , 6 , 7}.

그것은 Nomarski DIC, 어두운 필드, 또는 다른 현미경 기술을 가진 여부, 그들에 분광학을 수행 하기 전에 플라스 모나 시 나노 입자의 기본 특성을 이해 하는 것이 동등 하 게 중요 하다. 플라즈마의 분야에서, 나노 입자는 10-100 nm의 규모에 크기의 미 립 자로 정의 됩니다^8,9. 나노 입자는 다양 한 모양 (예: 구, 막대, 별, 덤 벨 등)에 걸릴 수 있으며 대부분의 중요 한 특성은 전자기 스펙트럼의 자외선 가시 근 적외선 범위에서 빛과의 상호 작용에서 발생 합니다. 용어 “플라스 몬”은 나노 입자¹⁰에 한정 되지 않고; 그러나, 나노 입자를 논의 할 때, 국 소 표면 플 라 즈 몬 공명 (LSPR)을 참조 하 여 사용 된다. LSPR은 나노 입자의 전도 전자가 매우 특이 하 고 상대적으로 좁은 주파수 대역의 전자기 복사와의 쿨롱 상호 작용으로 인해 진동 하는 현상이 며⁸. 이 같은 주파수에서, 플라스 모나 닉 나노 입자는 빛의 증가 된 흡수 및 산란을 나타내며, 광학 현미경으로 관찰 할 수 있습니다. 많은 경우에는, 콘덴서²보다는 대역 통과 필터를 배치 하면서 나노 입자를 관찰 하 고, 이미징 콘트라스트를 개선 하 고, lspr 효과를 유도 하지 못하는 빛을 제거 하는 것이 바람직하다. 또한 필터를 사용 하면 단일 입자 분 광 법 실험을 수행할 수 있습니다.

LSPR 관련 광학 거동은 나노 입자의 크기 및 형상에 크게 의존 하며, 많은 광학 현미경 기술로 조사 될 수 있다. 그러나, 이방성 (즉, 비 구형) 형상의 플라스 몬 계 나노 입자의 배 향 정보를 해독 하기 위해서는 광 필드의 편광을 활용 하는 것이 필요 하다. 편광 필드 또는 샘플 기판을 조금씩 조금씩 회전 시 킴으로써, 개별 나노 입자의 배 향 의존적 분 광 특성을 감시할 수 있다. 회전 및 분극은 또한 스펙트럼 기능이 나노 입자의 표면 전자의 디 폴라 또는 더 높은 순서의 발진으로 인 한 것인지 여부를 결정 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 등방성 (즉, 구형) 나노 입자의 경우, 스펙트럼 프로 파일은 편광 하에서 샘플을 회전할 때 본질적으로 변하지 않습니다.

DIC 현미경을 통해 볼 때 (그림 2), 나노 입자는 회색 배경에 대 한 그림자 캐스트 흰색과 검은색 모양으로 통풍 디스크. 구형 나노 입자는 회전 및 대역 통과 필터의 변화와 함께 이러한 외관을 유지 합니다; 그러나 필터의 중앙 파장이 구의 유일한 배위 lspr 파장 (¹¹)에서 더 분리 되는 것 처럼 입자가 점차 시야에서 사라질 것입니다. 나노로 ds의 외형은 회전 된²로 매우 극적으로 변할 수 있습니다. 나노로 ds에는 나노로의 물리적 치수를 기반으로 하는 두 개의 lspr 밴드 (배위 동작)가 있습니다. 나노 od의 종 축이 DIC 편광 필드 중 하 나와 평행 하 게 배 향 되 면, 바람이 잘 통하는 디스크는 LSPR 파장에 연결 된 대역 통과 필터로 볼 경우 모든 흰색 또는 모두 검은색으로 표시 됩니다. 샘플을 90 ° 회전 한 후에는 반대 색을 취할 것입니다. 대안적으로, 나노 od의 횡 축이 종 축에 수직인 것 이기 때문에, 로드는 두 축의 LSPR 파장에 일치 하는 필터 들 사이를 전환할 때 반대 색을 취할 것 이다. 다른 방향 및 필터 설정에서 나노 로드는 구형 처럼 보일 것 이며 다양 한 섀도우 캐스트 에어리 디스크 패턴을 제시 합니다. 가로 축 < 25nm의 나노로 ds의 경우 DIC 현미경을 사용 하 여 LSPR의 파장에서 신호를 감지 하는 것이 어려울 수 있습니다.

단일 입자 분 광 법을 수행 하려면 올바른 광학 구성 요소를 사용 하 고 올바르게 정렬 하는 것이 중요 합니다. DIC 현미경을 사용할 수 있는 대물 렌즈를 사용 해야 합니다. 단일 입자 실험의 경우 80 x 또는 100 배 오일 목표가 이상적입니다. Nomarski DIC 프리즘은 일반적으로 세 가지 종류로 제공: 표준, 고대비, 높은 해상도. 이상적인 유형은 실험의 목적과 나노 입자의 크기에 따라 크게 달라 집니다. 표준 프리즘 많은 실험에 대 한 괜 찮 아 요; 그러나 작은 나노 입자 (< 50 nm)로 작업 할 때 입자가 크기¹¹에서 감소 함에 따라 입자 대비가 감소 하므로 고대비 프리즘이 유리할 수 있습니다. DIC 콘트라스트 조정은 현미경 브랜드 또는 모델⁶에 따라 편광자를 회전 시키거나 dic 프리즘 중 하나를 번역 하 여 달성할 수도 있습니다.

Kohler 조명 및 편광자 설정을 설정한 후에는 분광학 데이터를 수집 하는 동안 이러한 설정을 재조정 하지 않는 것이 중요 합니다. 또한 필터와 각도 설정 사이를 전환 하는 경우에도 데이터를 수집 하는 동안 일정 한 평균 배경 신호가 항상 유지 되어야 합니다. 실제 이상적인 배경 값은 과학적 카메라의 동적 범위에 따라 다르지만 일반적으로 배경은 카메라의 최대 감지 레벨의 15%-40% 범위에 있어야 합니다. 이를 통해 최적의 입자 대비를 가능 하 게 하는 동시에 카메라 센서가 포화 될 가능성을 줄일 수 있습니다. 분광학 데이터를 수집 하기 위해서는 컬러 카메라가 아닌 흑백으로 이미지를 캡처하는 과학적 카메라로 작업 해야 합니다.

시료 전처리는 이미징 플라스틱 나노 입자의 또 다른 중요 한 측면입니다. DIC 현미경의 운영자는 샘플의 광학적 특성과 샘플의 기질에 대 한 이해가 필수적입니다. “사전 세척 된” 현미경 유리는 이미징 나노 입자를 충분히 준비 하지 않으며 샘플 증 착 전에 적절 하 게 재 세척 하 여 시료의 탁 트인 관찰을 보장 해야 합니다. 현미경 슬라이드에 대 한 많은 세척 프로토콜은 이전에 문서화 된¹², 하지만 그것은 일반적으로 실험 연구에서 보고 하는 단계.

마지막으로, 데이터 분석 방법은 단일 입자 분 광 법의 최종 구성 요소입니다. 각 나노 입자의 최대 및 최소 강도는 현지 배경 평균 뿐만 아니라 측정 되어야 합니다. 관심 입자는 배경 이물질, 기판 결함 또는 고르지 않은 조명이 없는 영역에 위치 해야 합니다. 나노 입자의 스펙트럼 프로 파일을 결정 하는 한 가지 방법은 각 파장에서 입자 대비를 계산 하는 것으로 서,도¹³,도¹⁵이하의 수학식을 사용 하 여:

또는, 단일 입자의 스펙트럼을 개별 최대 및 최소 신호 구성 요소로 분할할 수 있으며,이는 DIC의 두 편광 필드를 나타내며 동시에 수집 된 두 개의 방향 의존적 스펙트럼을 표시 합니다. 두 방정식을 통해:

Protocol

1. 표준 유리 현미경 슬라이드로 샘플 준비 샘플 증 착을 위한 유리 현미경 슬라이드를 준비 합니다.참고: 어떤 경우에는 에탄올 대신 초순 수에 유리를 저장 하는 것이 더 적절할 수 있다. 그러나 물 이나 공기에 저장 하는 것은 시간이 지남에 따라 유리의 소수 성을 만든다. 최상의 결과를 위해 유리 또는 석 영 현미경 슬라이드와 커버 유리를 구입 하십시오. 스크라이브 ?…

Representative Results

육안으로 볼 수 있을 만큼 큰 샘플을 사용 하 여 작업 할 때 유리 기판에 랜드마크를 배치 하는 것은 일반적으로 필요 하지 않습니다. 그러나 나노 물질을 사용 하거나 샘플의 회전이 필요한 경우, 랜드마크는 샘플의 방향을 찾고 구별 하 고 추적 하는 쉬운 방법을 제공할 수 있습니다. 유리 기판17에서 랜드마크를 떠나는 데 더 정교한 기술을 활용할 수 있…

Discussion

DIC 현미경으로 이미징 하는 경우 데이터를 수집 하기 전에 광학 부품을 최적화 하는 것이 중요 합니다. 실험 중간에 편광자를 약간만 조정 해도 최종 데이터⁶에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 다른 재료는 다른 편광자 설정이 필요 합니다. 편광 각도의 효과를 보여주기 위해 여기에 큰 스텝 사이즈를 활용 하였으나, 실제 실험에서는 최적의 콘트라스트 설정의 1 °-2 ° 내에서 …

Materials

Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm