Realización de espectroscopía en nanopartículas Plasmónicas con microscopía de contraste de interferencia diferencial de tipo Nomarski basado en la transmisión

Summary

El objetivo de este protocolo es detallar un enfoque comprobado para la preparación de muestras de nanopartículas plasmónicas y para realizar espectroscopía de partícula única en ellas con microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC).

Abstract

La microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) es una potente herramienta de imagen que se emplea con mayor frecuencia para objetos de microescala de imagen utilizando luz de rango visible. El propósito de este protocolo es detallar un método probado para preparar muestras de nanopartículas plasmónicas y realizar espectroscopía de partícula única en ellas con microscopía DIC. Varios pasos importantes deben seguirse cuidadosamente para realizar experimentos de espectroscopía repetible. Primero, los hitos pueden ser grabados en el sustrato de la muestra, que ayuda a localizar la superficie de la muestra y en el seguimiento de la región de interés durante los experimentos. A continuación, el sustrato debe limpiarse adecuadamente de escombros y contaminantes que de otro modo pueden obstaculizar u oscurecer el examen de la muestra. Una vez que una muestra se prepara correctamente, la trayectoria óptica del microscopio debe alinearse, utilizando Kohler Illumination. Con un microscopio DIC de estilo Nomarski estándar, la rotación de la muestra puede ser necesaria, especialmente cuando las nanopartículas plasmónicas exhiben propiedades ópticas dependientes de la orientación. Debido a que la microscopía DIC tiene dos campos de polarización ortogonal inherentes, el patrón de contraste DIC dependiente de la longitud de onda revela la orientación de las nanopartículas plasmónicas en forma de varilla. Finalmente, la adquisición de datos y los análisis de datos deben realizarse cuidadosamente. Es común representar datos de espectroscopía basada en DIC como un valor de contraste, pero también es posible presentarlo como datos de intensidad. En esta demostración de la DIC para la espectroscopía de una sola partícula, el foco se centra en las nanopartículas de oro esféricas y en forma de varilla.

Introduction

Desde la década de 1980, la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) se ha visto en gran medida como un importante método de imagen reservado para los objetos de microescala dentro de las ciencias biológicas. Sin embargo, durante su desarrollo en los años 1950 y 1960, fue concebido como una técnica para la ciencia de los materiales¹. Con los recientes avances en las Ciencias materiales relacionados con las nanopartículas plasmónicas, se ha realizado un mayor interés en la caracterización de materiales con microscopía óptica.

Muchas técnicas ópticas están sin duda disponibles para la caracterización de nanomateriales (por ejemplo, campo oscuro, campo claro, luz polarizada, fluorescencia, etc.). El campo oscuro es muy popular en la investigación de nanopartículas, pero se basa únicamente en la colección de dispersión y proporciona información limitada sobre muestras complejas². La fluorescencia puede ser útil, pero sólo con muestras que luminesce o que pueden ser debidamente teñidas. La microscopía DIC tiene varios rasgos que la convierten en una herramienta valiosa para el análisis de nanopartículas. Las ventajas más frecuentemente indicadas de la DIC en comparación con otros métodos y en lo que respecta a las nanopartículas plasmónicas son: no se requiere tinción de muestras, no hay efectos de Halo, profundidad de campo superficial y alta resolución lateral³. El DIC tiene fortalezas adicionales que son valiosas para la investigación de nanopartículas plasmónicas. En primer lugar, dos campos de polarización inherentes y ortogonales están presentes, y se pueden medir simultáneamente para fines de espectroscopía². En segundo lugar, la señal depolarizada de las nanopartículas no se captura en la imagen final², que puede ser una causa de grave preocupación en las mediciones de espectroscopía de campo oscuro.

El propósito de este artículo es proporcionar una metodología clara para la utilización de microscopía de Nomarski de luz transmitida para realizar espectroscopía en nanopartículas plasmónicas. Aunque la DIC es una técnica poderosa que se puede aplicar a materiales muy diversos, también es una técnica que requiere una gran habilidad y comprensión para operarla correctamente cuando se imaginan nanopartículas. La microscopía de la transmisión Nomarski con base en transmisiones tiene un camino ligero complejo¹ que solo se revisará brevemente aquí. El tren óptico de DIC se visualiza en la figura 1. La luz se transmite a través del microscopio, primero se pasa a través de un polarizador y un prisma de Nomarski que divide el haz antes de ser centrado por el condensador en el plano de la muestra. Después de pasar por el objetivo, la luz se encuentra con un Haz que combina el prisma Nomarski y un analizador antes de salir al detector. Los dos polarizadores y prismas de Nomarski son críticos para la formación de la imagen de DIC y son responsables de producir los dos campos de polarización ortogonal¹de Dic. Para el lector interesado en saber más sobre los principios de trabajo y la trayectoria óptica de los microscopios de Nomarski DIC, o las diferencias entre Nomarski DIC y otros estilos de DIC, por favor refiérase a otras cuentas bien escritas sobre estos temas^{1, 4 , 5 , 6 , 7}.

Es igualmente importante entender la naturaleza básica de las nanopartículas plasmónicas antes de intentar realizar espectroscopía en ellas, ya sea con Nomarski DIC, campo oscuro, o cualquier otra técnica de microscopía. En el campo de los plasmónicos, las nanopartículas se definen como partículas con dimensiones en la escala de 10-100 nm^8,9. Las nanopartículas pueden adoptar muchas formas (por ejemplo, esferas, varillas, estrellas, mancuernas, etc.), y la mayoría de sus propiedades importantes surgen de las interacciones con la luz en el rango infrarrojo ultravioleta-visible-cercano del espectro electromagnético. El término “plasmónico” no se restringe a las nanopartículas¹⁰; sin embargo, cuando se discuten las nanopartículas, se utiliza en referencia a la resonancia de Plasmon superficial localizada (LSPR). LSPR es un fenómeno en el que los electrones de conducción en una nanopartícula oscilan debido a una interacción Coulombic con la radiación electromagnética de una banda de frecuencias⁸muy específica y relativamente estrecha. A estas mismas frecuencias, las nanopartículas plasmónicas exhiben una mayor absorción y dispersión de la luz, haciéndolos observables con microscopía óptica. En muchos casos, se prefiere observar las nanopartículas mientras se colocan filtros de paso de banda antes del condensador², para mejorar el contraste de imagen y para eliminar la luz que no induce el efecto LSPR. El uso de filtros también hace posible realizar experimentos de espectroscopía de partículas individuales.

El comportamiento óptico relacionado con LSPR depende en gran medida del tamaño y la forma de las nanopartículas, y se puede investigar con muchas técnicas de microscopía óptica. Sin embargo, con el fin de descifrar la información de orientación de las nanopartículas plasmónicas con una forma anisotrópico (es decir, no esférica), es necesario utilizar la polarización del campo de luz. Al rotar cuidadosamente el campo de polarización o el sustrato de la muestra en pequeños incrementos, es posible monitorear las propiedades espectroscópicas dependientes de la orientación de las nanopartículas individuales. La rotación y la polarización también pueden ayudar a determinar si una característica espectral se debe a una oscilación de orden dipolares o superior de los electrones superficiales de la nanopartícula. Sin embargo, en el caso de nanopartículas isotrópicas (es decir, esféricas), el perfil espectral permanece esencialmente sin cambios al rotar la muestra bajo luz polarizada.

Cuando se ve a través de un microscopio DIC (figura 2), las nanopartículas tienen un disco aireado con un aspecto blanco y negro fundido a la sombra contra un fondo gris. Las nanopartículas esféricas mantendrán esta apariencia bajo rotación y con el cambio de filtros de paso de banda; sin embargo, las partículas se desvanecerán gradualmente de la vista a medida que la longitud de onda central del filtro se separa más de la única longitud de onda LSPR de la esfera¹¹. La aparición de nanorods puede cambiar drásticamente a medida que se giran². Los nanorods tienen dos bandas LSPR con comportamiento dipolares, cuya ubicación se basa en las dimensiones físicas de los nanorods. Cuando el eje longitudinal de un nanorod está orientado paralelo a uno de los campos de polarización DIC, el disco aireado aparecerá todo blanco o negro Si se visualiza con un filtro de paso de banda asociado con esa longitud de onda LSPR. Después de rotar la muestra 90 °, tomará el color opuesto. Alternativamente, dado que el eje transversal de un nanorod es perpendicular al eje longitudinal, la varilla tomará el color opuesto al cambiar entre filtros que coincidan con las longitudes de onda LSPR para los dos ejes. En otras orientaciones y configuraciones de filtro, las nanorods aparecerán más como esferas, presentando una variedad de patrones de disco aireados de sombra. Para nanorods con un eje transversal < 25 nm, puede ser difícil detectar la señal en la longitud de onda de LSPR utilizando la microscopía DIC.

Para realizar la espectroscopía de una sola partícula, es importante utilizar los componentes ópticos correctos y alinearlos correctamente. Se debe utilizar un objetivo capaz de microscopía DIC. Para experimentos de partículas individuales, los objetivos de aceite de 80x o 100x son ideales. Los prismas de Nomarski DIC normalmente vienen en tres variedades: estándar, alto contraste y alta resolución. El tipo ideal depende altamente del propósito del experimento y del tamaño de las nanopartículas. Los prismas estándar están bien para muchos experimentos; pero cuando se trabaja con nanopartículas más pequeñas (< 50 nm), los prismas de alto contraste pueden ser beneficiosos, ya que el contraste de partículas disminuye a medida que las partículas disminuyen en el tamaño¹¹. El ajuste del contraste DIC se consigue girando un polarizador o traduciendo uno de los prismas DIC, dependiendo de la marca del microscopio o del modelo⁶.

Después de configurar la iluminación de Kohler y los ajustes del polarizador, es fundamental no reajustar estos ajustes mientras se recopilan datos de espectroscopía. Además, se debe mantener una señal de fondo promedio constante en todo momento durante la recopilación de datos, incluso cuando se cambia entre los filtros y los ajustes de ángulo. El valor real de fondo ideal depende del rango dinámico de la cámara científica, pero en general, el fondo debe estar en el rango de 15% – 40% del nivel de detección máximo de la cámara. Esto reduce la probabilidad de saturar el sensor de la cámara al tiempo que permite un contraste de partículas óptimo. Para recopilar datos de espectroscopía, es necesario trabajar con una cámara científica que Capture imágenes en blanco y negro, en contraposición a una cámara a color.

La preparación de muestras es otro aspecto crítico de las nanopartículas plasmónicas por imágenes. Es imperativo que los operadores de la microscopía DIC tengan una comprensión de las propiedades ópticas de la muestra y del sustrato de la muestra. El cristal del microscopio “precaseados” no está suficientemente preparado para las nanopartículas de imagen, y debe volver a limpiarse correctamente antes de la deposición de la muestra para garantizar la observación sin obstrucciones de la muestra. Muchos protocolos de limpieza para las diapositivas de microscopio han sido documentados previamente¹², pero no es un paso que se divulga normalmente en estudios experimentales.

Finalmente, los métodos de análisis de datos son el componente final de la espectroscopía de partículas individuales. Se deben medir las intensidades máximas y mínimas para cada nanopartícula, así como la media de fondo local. Las partículas de interés deben estar ubicadas en áreas sin residuos de fondo, defectos de sustrato o iluminación irregular. Un método para determinar el perfil espectral de una nanopartícula es calculando el contraste de las partículas en cada longitud de onda, utilizando la ecuación inferior a^11,13,14,15:

Alternativamente, el espectro de una sola partícula se puede dividir en sus componentes individuales de señal máxima y mínima, que representan los dos campos de polarización de DIC, mostrando así los dos espectros dependientes direccionalmente que se recogen simultáneamente, a través de las dos ecuaciones:

Protocol

1. preparación de muestras con diapositivas de microscopía de vidrio estándar Prepare diapositivas de microscopio de vidrio para la deposición de muestras.Nota: en algunas circunstancias, puede ser más apropiado almacenar el vidrio en agua ultrapura en lugar de etanol. Sin embargo, el almacenamiento en agua o aire hace que el vidrio hidrófobo con el tiempo. Para obtener los mejores resultados, compre portaobjetos de vidrio o cuarzo y vidrio de cubierta. Usando una pluma de trazado, …

Representative Results

Cuando se trabaja con muestras que son lo suficientemente grandes como para ser vistos a simple vista, no se requiere normalmente colocar puntos de referencia en el sustrato de vidrio. Sin embargo, cuando se trabaja con nanomateriales o cuando se requiere la rotación de la muestra, los puntos de referencia pueden proporcionar un método fácil para ubicar, distinguir y rastrear la orientación de la muestra. Aunque se pueden utilizar técnicas más sofisticadas para dejar puntos de refer…

Discussion

Cuando se toma imágenes con microscopía DIC, es fundamental optimizar los componentes ópticos antes de recopilar datos. Incluso ajustes menores en el polarizador en medio de un experimento pueden resultar en impactos significativos en los datos finales⁶. Además, diferentes materiales requieren diferentes ajustes polarizadores. Aunque aquí se utilizaron grandes tamaños de paso para demostrar el efecto del ángulo de polarización, en un experimento real, es imprescindible optimizar el ajuste …

Materials

Contrad 70	Decon Labs, Inc.	1002	For cleaning microscope glass, Available through many chemical suppliers
Ethanol	Fisher Scientific	A962-4	For cleaning and storing microscope glass
Glass microscope cover slips	Ted Pella	260148
Glass microscope slides	Ted Pella	26007
Gold nanorods	Nanopartz	DIAM-SPR-25-650
Gold nanospheres (80 nm)	Sigma Aldrich	742023-25ML
ImageJ	NIH	N/A	Free Software availabe for data analysis from NIJ
Nail polish	Electron Microscopy Sciences	72180
Nikon Ti-E microscope	Nikon	N/A
Nitrogen gas	Airgas	N/A
ORCA Flash 4.0 V2+ digital sCMOS camera	Hamamatsu	77054098
Scribing pen	Amazon	N/A	Many options available online for under $10. Not necessary to buy an expensive version.
Ultrapure water			18 megaohm