JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

Isolatie van lipoproteïne deeltjes uit kippenei dooier voor de studie van bacteriële pathogeen vetzuur opname in membraan fosfolipiden

Published: May 15, 2019
doi:
10.3791/59538
, ,
1Department of Microbiology and Molecular Genetics,Michigan State University, 2Department of Physiology,Michigan State University

Summary

Deze methode biedt een kader voor het bestuderen van de opname van exogene vetzuren uit complexe gastheer bronnen in bacteriële membranen, met name Staphylococcus aureus. Om dit te bereiken, protocollen voor de verrijking van lipoproteïne deeltjes uit kip eierdooier en daaropvolgende vetzuur profilering van bacteriële fosfolipiden met behulp van massaspectrometrie worden beschreven.

Abstract

Staphylococcus aureus en andere gram-positieve pathogenen bevatten vetzuren uit het milieu in membraan fosfolipiden. Tijdens infectie, de meerderheid van exogene vetzuren aanwezig zijn binnen gastheer lipoproteïne deeltjes. Onzekerheid blijft over de reservoirs van gastheer vetzuren en de mechanismen waarmee bacteriën vetzuren uit de lipoproteïne deeltjes halen. In dit werk beschrijven we protocollen voor de verrijking van low-density lipoproteïne (LDL) deeltjes uit kippen eierdooier en bepalen of ldls dienen als vetzuur reservoirs voor S. aureus. Deze methode exploiteert onbevooroordeelde lipidomische analyse en kip LDLs, een effectief en economisch model voor het onderzoek van interacties tussen LDLs en bacteriën. De analyse van S. aureus integratie van exogene vetzuren uit ldls wordt uitgevoerd met behulp van hoge-resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie en tandem massaspectrometrie, waardoor de karakterisering van de vetzuur samenstelling van de bacteriële membraan en onbevooroordeelde identificatie van nieuwe combinaties van vetzuren die ontstaan in bacteriële membraan lipiden bij blootstelling aan LDLs. Deze geavanceerde massaspectrometrie technieken bieden een ongeëvenaard perspectief op de opname van vetzuren door het onthullen van de specifieke exogene vetzuren die in de fosfolipiden zijn opgenomen. De hier beschreven methoden zijn aanpasbaar aan de studie van andere bacteriële pathogenen en alternatieve bronnen van complexe vetzuren.

Introduction

Methicillaire-resistente S. aureus (MRSA) is de belangrijkste oorzaak van de gezondheidszorg-geassocieerde infectie en de bijbehorende antibioticaresistentie is een aanzienlijke klinische uitdaging1,2,3. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën een hoge prioriteit. Een veelbelovende behandelingsstrategie voor gram-positieve pathogenen is remming van de vetzuur synthese, een vereiste voor membraan fosfolipide productie die, in S. aureus, omvat dunlaag GLYCEROL (PG), lysyl-PG, en cardiolipine4. Bij bacteriën, vetzuur productie vindt plaats via de vetzuur synthese II Pathway (fasii)5, die aanzienlijk verschilt van de eukaryotische tegenhanger, waardoor fasii een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van antibiotica5,6 . FASII remmers richten voornamelijk op FabI, een enzym vereist voor vetzuur koolstofketen rek7. De Fabi-remmer triclosan wordt in grote lijnen gebruikt in consumenten-en medische goederen8,9. Er worden extra Fabi-remmers ontwikkeld door verschillende farmaceutische bedrijven voor de behandeling van S. aureus -infectie10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Echter, veel gram-positieve pathogenen, waaronder S. aureus, zijn geschikt voor het opruimen van exogene vetzuren voor fosfolipide synthese, omzeilen van fasii remming27,28,29. Zo wordt het klinische potentieel van fasii remmers besproken als gevolg van aanzienlijke lacunes in onze kennis van de bronnen van gastheer vetzuren en de mechanismen waarmee pathogenen vetzuren uit de gastheer27,28extract. Om deze lacunes aan te pakken, ontwikkelden we een onbevooroordeelde lipidomische analysemethode om de opname van exogene vetzuren uit lipoproteïne deeltjes in membraan fosfolipiden van S. aureuste monitoren.

Tijdens sepsis, gastheer lipoproteïne deeltjes vertegenwoordigen een potentiële bron van gastheer-afgeleide vetzuren binnen de vasculatuur, als een meerderheid van de gastheer vetzuren worden geassocieerd met de deeltjes30. Lipoproteïnen bestaan uit een hydrofiele schil bestaande uit fosfolipiden en eiwitten die een hydrofobe kern van triglyceriden en cholesterol esters31omsluiten. Vier belangrijke klassen van lipoproteins-chylomicron, zeer lage dichtheid lipoproteïne, high-density lipoproteïne, en low-density lipoproteïne (LDL) — worden geproduceerd door de gastheer en de functie als lipide vervoer voertuigen, leveren van vetzuren en cholesterol van en naar cellen hosten via de vasculatuur. LDLs zijn overvloedig in veresterd vetzuur, met inbegrip van triglyceriden en cholesterol esters31. We hebben eerder aangetoond dat zeer gezuiverde menselijke Ldl’s een levensvatbare bron van exogene vetzuren voor PG-synthese zijn, waardoor een mechanisme wordt geboden voor de bypass van de FASII-remmer32. Zuiverende menselijke Ldl’s kunnen technisch uitdagend en tijdrovend zijn, terwijl commerciële bronnen van gezuiverde menselijke Ldl’s buitensporig duur zijn om routinematig te gebruiken of grootschalige bacteriële schermen uit te voeren. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een procedure voor de verrijking van LDLs van kip eierdooier, een rijke bron van lipoproteïne deeltjes33gewijzigd. We hebben met succes ongerichte, hoge-resolutie/nauwkeurige massaspectrometrie en tandem massaspectrometrie gebruikt om de opname van menselijke LDL-afgeleide vetzuren in het membraan van S. aureus32te monitoren. In tegenstelling tot eerder gemelde methoden, deze aanpak kan kwantificeren individuele vetzuur-isomeren voor elk van de drie belangrijkste Staphylococcus fosfolipide typen. Oliezuur (18:1) is een onverzadigd vetzuur aanwezig in alle gastheer lipoproteïne deeltjes die gemakkelijk is opgenomen in S. aureus fosfolipiden29,30,32. S. aureus is niet geschikt voor oliezuur synthese29; Daarom, de hoeveelheid fosfolipide-opgenomen oliezuur stelt de aanwezigheid van gastheer lipoprotein-afgeleide vetzuren binnen de Staphylococcus membraan29. Deze fosfolipide soorten kunnen worden geïdentificeerd door de State-of-the-art massaspectrometrie methode hier beschreven, het aanbieden van een ongekende resolutie van de membraan samenstelling van S. aureus gekweekt in de aanwezigheid van een vetzuur bron het waarschijnlijk ontmoetingen tijdens infectie.

Protocol

Opmerking: het volgende protocol voor de verrijking van LDL-deeltjes uit kippen eierdooier is afgeleid van Moussa et al. 200233. 1. bereiding van kippenei dooier voor verrijking van LDL-deeltjes Sanitize twee grote kippeneieren door de schelpen te wassen met 70% ethanol oplossing en laat drogen. Ontsmettings de Eier separator met behulp van 70% ethanol oplossing en laat de lucht drogen. Bevestig de Eier separator op de lip van een middelgroot bekergl…

Representative Results

Het protocol voor de verrijking van LDL van kippenei dooier wordt geïllustreerd in Figuur 1. Dit proces begint met het verdunen van hele eidooier met een zoutoplossing en het scheiden van de eierdooiers die korrels worden genoemd uit de oplosbare of plasma fractie die de Ldl’s bevat (Figuur 1)33. Het LDL-gehalte van de plasma fractie wordt verder verrijkt door precipitatie van de ~ 30-40 kDa β-livetinen …

Discussion

S. aureus bevat exogene vetzuren in zijn membraan fosfolipiden27,32,43. Fosfolipide synthese met behulp van exogene vetzuren omzeilt fasii remming, maar verandert ook de biofysische eigenschappen van het membraan27,32,44. Hoewel de opname van exogene vetzuren in fosfolipiden van gram-positieve pathogenen goed gedocumenteerd is,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken de leden van het Hammer Laboratory voor hun kritische evaluatie van het manuscript en de ondersteuning van dit werk. Dr. Alex Horswill van de Universiteit van Colorado school of Medicine vriendelijk voorzien AH1263. Dr. Chris Waters Laboratory aan de Michigan State University verstrekt reagentia. Dit werk werd gesteund door de Amerikaanse hart vereniging Grant 16SDG30170026 en start-up fondsen voorzien door Michigan State University.

Materials

Ammonium sulfate Fisher BP212R-1 ≥99.5% pure
Cell culture incubator Thermo MaxQ 6000
Centrafuge Thermo 75-217-420 Sorvall Legen XTR, rotor F14-6×250 LE
Costar assay plate Corning 3788 96 well
Filter paper Schleicher & Schuell 597
Large chicken egg N/A N/A Common store bought egg
Microplate spectrophotometer BioTek Epoch 2
NaCl Sigma S9625
S. aureus strain AH1263 N/A N/A Provided by Alex Horswill of the University of Colorado
Dialysis tubing Pierce 68700 7,000 MWCO
Tryptone Becton, Dickison and Company 211705
0.5 mm zirconium oxide beads Next Advance ZROB05
Bullet Blender Next Advance BBX24B
Methanol (LC-MS grade) Fisher A4561
Chloroform (reagent grade) Fisher MCX10559
Isopropanol (LC-MS grade) Fisher A4611
Dimyristoyl phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 850345C-25mg
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 ≥99.5% pure
Ammonium formate Sigma 70221-25G-F
Xcalibur software Thermo Scientific OPTON-30801
LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer Thermo Scientific high resolution/accurate mass MS
Agilent 1260 capillary HPLC Agilent
SpeedVac Vacuum Concentrators Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Noskin, G. A., et al. National trends in Staphylococcus aureus infection rates: impact on economic burden and mortality over a 6-year period (1998-2003). Clinical Infectious Diseases. 45 (9), 1132-1140 (2007).
  2. Noskin, G. A., et al. The burden of Staphylococcus aureus infections on hospitals in the United States: an analysis of the 2000 and 2001 Nationwide Inpatient Sample Database. Archives of Internal Medicine. 165 (15), 1756-1761 (2005).
  3. Laible, B. R. Antimicrobial resistance: CDC releases report prioritizing current threats. South Dakota medicine. 67 (1), 30-31 (2014).
  4. Zhang, Y. M., Rock, C. O. Membrane lipid homeostasis in bacteria. Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 222-233 (2008).
  5. Zhang, Y. M., White, S. W., Rock, C. O. Inhibiting bacterial fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 281 (26), 17541-17544 (2006).
  6. Sohlenkamp, C., Geiger, O. Bacterial membrane lipids: diversity in structures and pathways. FEMS Microbiology Reviews. 40 (1), 133-159 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. Staphylococcus aureus FabI: inhibition, substrate recognition, and potential implications for in vivo essentiality. Structure. 20 (5), 802-813 (2012).
  8. Heath, R. J., Li, J., Roland, G. E., Rock, C. O. Inhibition of the Staphylococcus aureus NADPH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase by triclosan and hexachlorophene. Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4654-4659 (2000).
  9. Heath, R. J., Yu, Y. T., Shapiro, M. A., Olson, E., Rock, C. O. Broad spectrum antimicrobial biocides target the FabI component of fatty acid synthesis. Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30316-30320 (1998).
  10. Park, H. S., et al. Antistaphylococcal activities of CG400549, a new bacterial enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI) inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (3), 568-574 (2007).
  11. Schiebel, J., et al. Rational design of broad spectrum antibacterial activity based on a clinically relevant enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 289 (23), 15987-16005 (2014).
  12. Yum, J. H., et al. In vitro activities of CG400549, a novel FabI inhibitor, against recently isolated clinical staphylococcal strains in Korea. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (7), 2591-2593 (2007).
  13. Kaplan, N., et al. Mode of action, in vitro activity, and in vivo efficacy of AFN-1252, a selective antistaphylococcal FabI inhibitor. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (11), 5865-5874 (2012).
  14. Karlowsky, J. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Hoban, D. J., Zhanel, G. G. AFN-1252, a FabI inhibitor, demonstrates a Staphylococcus-specific spectrum of activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (8), 3544-3548 (2009).
  15. Ross, J. E., Flamm, R. K., Jones, R. N. Initial broth microdilution quality control guidelines for Debio 1452, a FabI inhibitor antimicrobial agent. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (11), 7151-7152 (2015).
  16. Hunt, T., Kaplan, N., Hafkin, B. Safety, tolerability and pharmacokinetics of multiple oral doses of AFN-1252 administered as immediate release (IR) tablets in healthy subjects. Journal of Chemotherapy. 28 (3), 164-171 (2016).
  17. Hafkin, B., Kaplan, N., Hunt, T. L. Safety, tolerability and pharmacokinetics of AFN-1252 administered as immediate release tablets in healthy subjects. Future Microbiology. 10 (11), 1805-1813 (2015).
  18. Flamm, R. K., Rhomberg, P. R., Kaplan, N., Jones, R. N., Farrell, D. J. Activity of Debio1452, a FabI inhibitor with potent activity against Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp., including multidrug-resistant strains. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (5), 2583-2587 (2015).
  19. Yao, J., Maxwell, J. B., Rock, C. O. Resistance to AFN-1252 arises from missense mutations in Staphylococcus aureus enoyl-acyl carrier protein reductase (FabI). Journal of Biological Chemistry. 288 (51), 36261-36271 (2013).
  20. Tsuji, B. T., Harigaya, Y., Lesse, A. J., Forrest, A., Ngo, D. Activity of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, against Staphylococcus aureus in an in vitro pharmacodynamic model simulating human pharmacokinetics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 32-35 (2013).
  21. Parsons, J. B., et al. Perturbation of Staphylococcus aureus gene expression by the enoyl-acyl carrier protein reductase inhibitor AFN-1252. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (5), 2182-2190 (2013).
  22. Kaplan, N., et al. In vitro activity (MICs and rate of kill) of AFN-1252, a novel FabI inhibitor, in the presence of serum and in combination with other antibiotics. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 18-25 (2013).
  23. Kaplan, N., Garner, C., Hafkin, B. AFN-1252 in vitro absorption studies and pharmacokinetics following microdosing in healthy subjects. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (3-4), 440-446 (2013).
  24. Banevicius, M. A., Kaplan, N., Hafkin, B., Nicolau, D. P. Pharmacokinetics, pharmacodynamics and efficacy of novel FabI inhibitor AFN-1252 against MSSA and MRSA in the murine thigh infection model. Journal of Chemotherapy. 25 (1), 26-31 (2013).
  25. Karlowsky, J. A., et al. In vitro activity of API-1252, a novel FabI inhibitor, against clinical isolates of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (4), 1580-1581 (2007).
  26. Yao, J., et al. A Pathogen-Selective Antibiotic Minimizes Disturbance to the Microbiome. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (7), 4264-4273 (2016).
  27. Brinster, S., et al. Type II fatty acid synthesis is not a suitable antibiotic target for Gram-positive pathogens. Nature. 458 (7234), 83-86 (2009).
  28. Balemans, W., et al. Essentiality of FASII pathway for Staphylococcus aureus. Nature. 463 (7279), E3-E4 (2010).
  29. Parsons, J. B., Frank, M. W., Subramanian, C., Saenkham, P., Rock, C. O. Metabolic basis for the differential susceptibility of Gram-positive pathogens to fatty acid synthesis inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15378-15383 (2011).
  30. Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), e0116195 (2015).
  31. Feingold, K. R., Grunfeld, C. Introduction to Lipids and Lipoproteins. Endotext. , (2000).
  32. Delekta, P. C., Shook, J. C., Lydic, T. A., Mulks, M. H., Hammer, N. D. Staphylococcus aureus utilizes host-derived lipoprotein particles as sources of exogenous fatty acids. Journal of Bacteriology. 200 (11), (2018).
  33. Moussa, M., Marinet, V., Trimeche, A., Tainturier, D., Anton, M. Low density lipoproteins extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology. 57 (6), 1695-1706 (2002).
  34. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. Bligh and Dyer and Folch Methods for Solid-Liquid-Liquid Extraction of Lipids from Microorganisms. Comprehension of Solvatation Mechanisms and towards Substitution with Alternative Solvents. International journal of molecular sciences. 18 (4), (2017).
  35. Lydic, T. A., Busik, J. V., Reid, G. E. A monophasic extraction strategy for the simultaneous lipidome analysis of polar and nonpolar retina lipids. Journal of Lipid Research. 55 (8), 1797-1809 (2014).
  36. Bowden, J. A., Bangma, J. T., Kucklick, J. R. Development of an automated multi-injection shotgun lipidomics approach using a triple quadrupole mass spectrometer. Lipids. 49 (6), 609-619 (2014).
  37. Haimi, P., Uphoff, A., Hermansson, M., Somerharju, P. Software tools for analysis of mass spectrometric lipidome data. Analytical Chemistry. 78 (24), 8324-8331 (2006).
  38. Hewelt-Belka, W., et al. Comprehensive methodology for Staphylococcus aureus lipidomics by liquid chromatography and quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1362, 62-74 (2014).
  39. Jolivet, P., Boulard, C., Beaumal, V., Chardot, T., Anton, M. Protein components of low-density lipoproteins purified from hen egg yolk. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (12), 4424-4429 (2006).
  40. Bylesjö, M., et al. OPLS discriminant analysis: combining the strengths of PLS-DA and SIMCA classification. Journal of Chemometrics. 20 (8-10), 341-351 (2006).
  41. Noble, R. C., Cocchi, M. Lipid metabolism and the neonatal chicken. Progress in Lipid Research. 29 (2), 107-140 (1990).
  42. Cherian, G., Holsonbake, T. B., Goeger, M. P. Fatty acid composition and egg components of specialty eggs. Poultry Science. 81 (1), 30-33 (2002).
  43. Parsons, J. B., Frank, M. W., Rosch, J. W., Rock, C. O. Staphylococcus aureus Fatty Acid Auxotrophs Do Not Proliferate in Mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (11), 5729-5732 (2013).
  44. Sen, S., et al. Growth-Environment Dependent Modulation of Staphylococcus aureus Branched-Chain to Straight-Chain Fatty Acid Ratio and Incorporation of Unsaturated Fatty Acids. PLoS One. 11 (10), e0165300 (2016).
  45. Wang, M., Huang, Y., Han, X. Accurate mass searching of individual lipid species candidates from high-resolution mass spectra for shotgun lipidomics. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 28 (20), 2201-2210 (2014).
  46. Peti, A. P. F., Locachevic, G. A., Prado, M. K. B., de Moraes, L. A. B., Faccioli, L. H. High-resolution multiple reaction monitoring method for quantification of steroidal hormones in plasma. Journal of Mass Spectrometry. 53 (5), 423-431 (2018).
  47. Neves, M. M., Heneine, L. G. D., Henry, M. Cryoprotection effectiveness of low concentrations of natural and lyophilized LDL (low density lipoproteins) on canine spermatozoa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinaria e Zootecnia. 66 (3), 769-777 (2014).
  48. Liu, P. V., Hsieh, H. C. Inhibition of Protease Production of Various Bacteria by Ammonium Salts – Its Effect on Toxin Production and Virulence. Journal of Bacteriology. 99 (2), 406 (1969).
  49. Suller, M. T., Russell, A. D. Triclosan and antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 46 (1), 11-18 (2000).
  50. Yao, C. H., Liu, G. Y., Yang, K., Gross, R. W., Patti, G. J. Inaccurate quantitation of palmitate in metabolomics and isotope tracer studies due to plastics. Metabolomics. 12, (2016).

Tags

Keywords: Lipoprotein ParticlesChicken Egg YolkBacterial PathogenFatty Acid IncorporationMembrane PhospholipidsLipidomic AnalysisStaphylococcus AureusAmmonium SulfateDialysis
check_url/cn/59538?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Delekta, P. C., Lydic, T. A., Hammer, N. D. Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids. J. Vis. Exp. (147), e59538, doi:10.3791/59538 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image