荧光苏门答腊蛋白对 sumo 修饰蛋白的定位
Summary
SUMO 是一种必需的、高度保守的、类似于泛素的改性剂。在这个协议中, 我们描述了使用一个抗压力重组的 sumo 捕获蛋白 (kmUTAG) 来可视化本地的、未标记的 SUMMO 共轭及其在各种细胞类型中的定位。
Abstract
在这里, 我们提出了一种新的方法来研究蛋白质的超一色化及其亚细胞定位在哺乳动物细胞和线虫卵母细胞。该方法利用重组修饰的 sumo 捕获蛋白片段 kmutag, 来源于抗压性酵母kluyveromyces marxianus的 up1 sumo 蛋白酶。我们调整了 Kumutag 的特性, 以便在不使用抗体的情况下研究各种模型系统中的超酰化。对于 SUMO 的研究, 与基于抗体的方法相比, Kumutag 有几个优点。这种抗压力的 sumo 捕获试剂是重组生产的, 它能识别来自许多物种的原生 sumo 异形, 与市售抗体不同的是, 它显示出对自由、非共轭的 SUMO 的亲和力降低。这里显示的代表性结果包括 SUMO 结合物在哺乳动物组织培养细胞和线虫卵母细胞中的定位。
Introduction
该方法的目的是利用重组的 sumo 捕获 UTAG (uLp 域标记) 蛋白, 促进对 sumo 共轭蛋白的研究和分析。如下文所述, UTAG 可用于替代其他试剂和方法来纯化、检测和可视化 sumo 修饰的蛋白质。根据生长条件, 细胞可能含有数百或数千种蛋白质, 这些蛋白质通过 SUMO 或 SUMO 链进行改性 (审查见 Kerscher 等人, 2006年1和 Kerscher2016 2)。这代表了一个相当大的困难, 具体的 sumo 修饰蛋白的功能分析, 特别是因为只有一小部分的特定的亚模化目标实际上是改性3。除了它们在基本的细胞过程中的作用, 如转录调控, 蛋白质稳态, 对细胞压力的反应, 和染色质重塑有丝分裂和减数分裂;现在已经足够清楚的是, sumo、sumo 修饰蛋白和 sumo 途径成分也有可能成为癌症和神经退行性疾病等疾病的生物标志物4,5,6 ,7。这突出表明, 需要强大、可靠和易于获得的工具和创新方法, 以便在各种细胞和样品中检测和功能分析 summo 修饰的蛋白质。
在许多系统中, sumo 特异性抗体是检测、分离和功能分析 sumo 修饰蛋白8,9的首选试剂。然而, 一些市售的 sumo 特异性抗体价格昂贵, 数量或可用性有限, 容易表现出疯狂的亲和力和交叉反应性,在某些情况下缺乏重现性10。另一种方法是在转化后的细胞和生物体中表达表位标记的 SUMO, 但将表位标记连接到 SUMO 可能会人为地降低其与蛋白质靶标11的共轭。此外, 在评估未转化的细胞或组织时, 表位也没有用处。
Ulp1 是一种保存的 SUMO 蛋白酶, 来自酿酒酵母, 它同时处理 sumo 前体和 desumoylates sumo 共轭蛋白12。我们开发了 UTAG 试剂的基础上的偶然观察, 在 Ulp1 的 SUMO 处理ulp OMAIN (ud) 中催化半胱氨酸 (c80s) 的突变不仅可以防止 sumo 裂解, 而且还可以捕获具有高含量的 sumo 共轭蛋白亲和力12。为了简单起见, 我们将这个盒式端子的 sumoapm 捕获 Ulp1(C580S) 片段称为 UTAG (UD TAG 的缩写)。UTAG 是一种重组的泛 sumo 捕获蛋白, 它是用于分离和检测 sumo 修饰蛋白的抗 sumo 抗体的一种有用替代品。重要的是, 它特别识别本土折叠, 共轭 SUMO, 而不仅仅是一个或几个表位在 SUMO。为了提高 UTAG 的蛋白质稳定性和 SUMO 结合强度, 我们从耐压酵母马夏努斯 (km) 中产生了 UTAG 的变种。Kumutag 紧密地结合了与纳米摩尔亲和力13的 sumo 共轭.此外, kmUTAG 耐高温 (42°c)、还原剂 (5 mM TCEP-Tris(2-羧基乙基) 盐酸磷化氢)、变性剂 (高达 2 M 尿素)、氧化剂 (0.6% 过氧化氢) 和非离子洗涤剂。这种应激耐受在苛刻的净化条件和长时间的孵育时间是有益的, 确保其稳定性和 sumo 捕获活性。然而, 毫不奇怪, KmUTAG 的 Sumo-bapege 活性与半胱氨酸修饰试剂、离子洗涤剂和完全变性的蛋白质提取物不兼容。KmUTAG 的显著亲和力和特性表明, 这种试剂可能成为研究多个物种中的超酰化蛋白质的标准试剂的一部分。
在这里, 我们提供了一个简单的方法来检测哺乳动物细胞和线虫中的 summo 修饰蛋白使用重组荧光 Mcherry-kumutag 融合蛋白 (Kumtag-fl)。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们介绍了 kmUTAG-fl 的使用, 一种重组蛋白, 在固定的哺乳动物细胞和解剖线虫性腺的功能研究 sumo。Kumutag-fl 是一种抗压的泛 sumo 特异性试剂, 可识别和捕获原生 sumo 结合蛋白和 SUMO 链。由于 SUMO 的三级结构是高度保守的, 因此很有可能使用 kmUTAG-fl 试剂来分析来自附加模型和非模型系统的 SUMO 变种。因此, KmUTAG-fl 可能是传统抗体染色协议的一种有用的替代试剂或继发试剂。
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 Kerscher 实验室的所有成员的支持, 感谢 Nathalie Nguyen 对手稿的批评阅读, 并感谢 Lidia Epp 对测序。这项工作得到了英联邦研究商业化基金 MF16-034-LS 的支持。贝利-赫斯顿研究基金和查尔斯中心颁发的 ry 和 ch 奖奖学金为 w & m 学生提供研究支持。
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
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