Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu
Summary
SUMO temel ve son derece uyumlu, küçük Ubiquitin-gibi değiştirici protein. Bu protokolde biz bir stres toleranslı rekombinant SUMO-bindirme proteini (kmUTAG) yerel, etiketlenmemiş SUMO konjugleri ve çeşitli hücre türlerinde lokalizasyonu görselleştirmek için kullanımını tarif ediyoruz.
Abstract
Burada proteinlerin sumoylation ve memelide hücreler ve Nematot oositlerde alt hücresel lokalizasyonu incelemek için bir yeni yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, rekombinant değiştirilmiş bir SUMO-bindirme protein parçası, kmUTAG, stres toleranslı tomurcuklanan Maya Kluyveromyces marxianusUlp1 Sumo proteaz türetilir kullanır. Biz antikorlar kullanmadan çeşitli model sistemlerinde sumoylation okumak amacıyla kmUTAG özelliklerini adapte ettik. SUMO çalışması için, KmUTAG antikor tabanlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları vardır. Bu stres toleranslı Sumo-bindirme reaktif rekombinantly üretilir, birçok türün yerel Sumo izoformlarının tanır, ve ticari olarak mevcut antikorlar aksine ücretsiz, bilirubinin Sumo için azaltılmış yakınlık gösterir. Burada gösterilen temsili sonuçlar, memeli doku kültürü hücrelerinde ve Nematot oositlerde SUMO konjugatın lokalizasyonunu içerir.
Introduction
Bu yöntemin amacı, rekombinant SUMO-bindirme UTAG (ULP Domain Tag) proteini kullanarak Sumo-konjueli proteinlerin çalışma ve analizini kolaylaştırmaktır. Aşağıda ayrıntılı olarak, UTAG diğer reaktifler ve yaklaşımlar arındırmak, algılamak ve SUMO-modifiye proteinleri görselleştirmek yerine kullanılabilir. Büyüme koşullarına bağlı olarak, hücreler, SUMO veya SUMO zincirleri ile değiştirilmiş yüzlerce veya binlerce protein içerebilir (gözden geçirmek için bkz: Kerscher ve al. 20061 ve kerscher 20162). Bu özel SUMO-modifiye proteinlerin fonksiyonel analizleri için önemli bir zorluk temsil eder, özellikle bir sumoylation hedef sadece bir kısmı aslında değiştirilmiş beri3. Transkripsiyon düzenlemesi, protein homeostaz, hücresel stres tepkisi ve mitoz ve Meiosis sırasında kromatin remodeling gibi temel hücresel süreçlerde rollerine ek olarak; Şimdi, sumo, sumo-modifiye proteinlerin ve sumo yolu bileşenlerinin kanser ve nörodejeneratif bozukluklar gibi patolojiler için biyolojik olarak potansiyeline sahip olduğu yeterince açık hale gelmiştir4,5,6 ,7. Bu, çeşitli hücreler ve örneklerde SUMO-değiştirilmiş proteinlerin algılanması ve işlevsel analizi için sağlam, güvenilir ve kolaylıkla kullanılabilen araçlara ve yenilikçi yaklaşımlara ihtiyaç duydukları altını çiziyor.
Birçok sistemde, sumo spesifik antikorlar, sumo modifiye proteinlerin algılama, yalıtım ve fonksiyonel analizleri için tercih edilen reaktifler8,9. Ancak, bazı piyasadaki Sumo özgü antikorlar pahalı, miktar veya kullanılabilirlik sınırlı, çılgınca değişken benzeşimleri ve çapraz-reaktivite sergiler eğilimli, ve bazı durumlarda eksikliği tekrarlanabilirlik10. Bir alternatif yaklaşım, dönüştürülmüş hücreler ve organizmalarda epitopu etiketli Sumo ifadesidir, fakat epitopu etiketlerini Sumo ‘ya bağlamak, konjugasyonu protein hedefleri11‘ e yapay olarak düşürebilir. Ayrıca, dönüştürülmüş hücreler veya dokularda değerlendirildiğinde epiterler yararlı değildir.
Ulp1, hem SUMO öncüleri hem de SUMO-konjuli proteinlerin12‘ sini işleyen S. cerevisiae ‘den kullanılan bir sumo proteaz. Biz serendipitous gözlem dayalı UTAG reaktif geliştirilen katalitik sistein bir mutasyon (C580S) içinde Ulp1’s SUMO işleme ULP domain (UD) sadece Sumo yarık önler ama aynı zamanda tuzaklar Sumo-konjuge proteinleri yüksek avidite12. Basitlik için, bu karboky-Terminal SUMO-bindirme Ulp1 (C580S) parçası UTAG (UD TAG için kısa) olarak adlandırılır. UTAG, SUMO-modifiye proteinlerin yalıtımı ve tespiti için kullanılan anti-SUMO antikorları için yararlı bir alternatif gösteren rekombinant Pan-SUMO bindirme proteindir. Önemlisi, özellikle yerel-katlanmış, konjuge Sumo ve sadece bir veya birkaç epitopları Sumo tanır. Hem protein istikrar ve UTAG SUMO bağlama gücü geliştirmek için, biz stres toleranslı Maya Kluyveromyces marxianus (km) utag bir varyantı oluşturdu. KmUTAG, SUMO-conjugates ‘ i nanomolar yakınlık13ile sıkıca bağlar. Ayrıca, kmutag yüksek sıcaklıklara (42 °c), azaltıcı maddeler (5 mm tcep-Tris (2-karbokoksit) phosphine hidroklorür), denatüranlar (en fazla 2 M Urea), oksitleyici maddeler (0,6% hidrojen peroksitler) ve Non-İyonik deterjanlar dayanıklıdır. Bu stres toleransı, sert arıtma durumu ve uzun süreli kuluçak süreleri sırasında yararlıdır, istikrar ve SUMO bindirme etkinliğini sağlayarak. Ancak, KmUTAG ‘ın SUMO bindirme aktivitesi, sistein değiştiren reaktifler, iyonik deterjanlar ve tam denatüre protein özler ile uyumsuzdur. KmUTAG ‘ın olağanüstü yakınlık ve özellikleri, bu reaktif, birden fazla türün sumoylated proteinlerin çalışması için standart repertuar bir parçası haline gelebilir gösterir.
Burada bir rekombinant floresan mCherry-KmUTAG Fusion protein (kmUTAG-FL) kullanarak memeliler hücrelerinde ve nematdes içinde SUMO-modifiye proteinleri algılamak için basit bir yöntem sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kmutag-fl kullanımı, Rekombinant protein, sabit memelinin hücrelerinde Sumo fonksiyonel çalışmalar ve disseke nematod gonads için tanıtmak. KmUTAG-fl bir stres toleranslı Pan-SUMO özel reakajdır tanır ve yerel SUMO konjuti proteinleri ve SUMO zincirleri yakalar. SUMO ‘nun üçüncül yapısı son derece iyi bir şekilde saklanmış olduğundan, ek model ve model olmayan sistemlerin SUMO türevleri kmUTAG-fl reakajıyla analiz edilebilir. Bu nedenle, KmUTAG-fl geleneksel antikor boyama protokolleri içi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onların destek için Kerscher laboratuar tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum, Nathalie Nguyen el yazması kritik okuma için, ve Lidia EPP sıralamayı için. Bu iş Commonwealth Research ticarileştirme Fonu MF16-034-LS OK tarafından desteklenmektedir. W & M öğrencileri için araştırma desteği, Bailey-Huston Araştırma Fonu ve Charles Center Honors Burslar tarafından RY ve CH ‘e sağlandı.
Materials
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | |
| 6-Well Cell Culture Plates | Genesee Scientific/Olympus Plastics | 25-105 | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | Gibco 14190144 | |
| Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-485-146 | Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody |
| Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses | Fisherbrand | 12545101 | |
| FLUORO-GEL II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 50-246-93) | Mounting media in step 1.11 |
| FLUORO-GEL with DABCO | Electron Microscopy Sciences | 17985-02 | With DAPI added to 1 µg/mL; mounting media in step 2.2.5 |
| Glycine-HCl | Fisher BioReagents | BP3815 | |
| Glycine-HCl | ACROS Organics | 6000-43-7 | |
| KmUTAG-fl | Kerafast | KmUTAG reagents are available on Kerafast.com | |
| Oneblock Western-CL blocking buffer | Prometheus | 20-313 | |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution | Fisher BioReagents | BP3994 | |
| PNT2 cell line | Sigma-Aldrich | 95012613 | Normal prostate epithelium immortalized with SV40. |
| pSPOT1 | (ChromoTek GmbH) | ev-1 | https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf |
| SUMO 6F2 | DSHB | SUMO 6F2 | SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2) |
| SUMO protease buffer [10x] | 500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl | ||
| SUMO-2 Antibody 8A2 | DSHB | SUMO-2 8A2 | SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2) |
| TCEP-HCL | GoldBio | 51805-45-9 | Used as a reducing agent at a concentration of 5mM |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | 9002-93-1 | Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms) |
References
- Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins. Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).
- Kerscher, O. . SUMOylation. , 1-11 (2016).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).
- Fu, J., et al. Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration. PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).
- Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer. Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).
- Wang, Q., et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis. Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).
- Karami, S., et al. Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates β-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation. Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).
- Pelisch, F., et al. A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis. Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).
- Zhang, X. D., et al. SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis. Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).
- Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).
- Wang, Z., Prelich, G. Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation. Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).
- Li, S. J., Hochstrasser, M. A new protease required for cell-cycle progression in yeast. Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).
- Peek, J., et al. SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease. PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).
- Edgar, L. G. Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis. Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).
- Pelisch, F., et al. Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).
- Dillingham, M. S., et al. Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity. Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).
- Ruckman, J., et al. 2′-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).
- Hughes, D. J., et al. Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology. Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).
- Lopata, A., et al. Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells. Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).
- Gilbreth, R. N., et al. Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).
- Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies. Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).
