Le silençage du gène médiévirus lentiviral dans le pseudoislet humain préparé dans les plaques à faible attachement

Summary

Un protocole pour créer des pseudoislets humains modifiés de gène des cellules humaines dispersées d’îlots qui sont transduced par lentivirus portant l’ARN court d’épingle à cheveux (shRNA) est présenté. Ce protocole utilise des vaisseaux d’enzymes et de culture facilement disponibles, peut être exécuté facilement, et produit des pseudoislets humains génétiquement modifiés appropriés pour des études fonctionnelles et morphologiques.

Abstract

Divers outils génétiques sont disponibles pour moduler les gènes dans les îlots pancréatiques des rongeurs pour disséquer la fonction des gènes des îlots pour la recherche sur le diabète. Cependant, les données obtenues à partir d’îlots de rongeurs ne sont souvent pas entièrement reproduites ou applicables aux îlots humains en raison de différences bien connues dans la structure et la fonction des îlots entre les espèces. Actuellement, les techniques qui sont disponibles pour manipuler l’expression génique des îlots humains sont très limitées. L’introduction du transgène dans les îlots intacts par l’adénovirus, le plasmide et les oligonucléotides souffre souvent d’une faible efficacité et d’une toxicité élevée. La faible efficacité est particulièrement problématique dans les études de dérégulation des gènes dans les îlots intacts, qui exigent une grande efficacité. On sait que les cellules d’îlots enzymatiquement dispersées se réagrégent dans la culture formant des sphéroïdes appelés pseudoislets. La réaggrége des cellules humaines d’îlots contrôlées par la taille crée des pseudoislets qui maintiennent la sécrétion dynamique d’insuline de première phase après une culture prolongée et fournissent une fenêtre pour introduire efficacement l’ARN lentiviral à épingle à cheveux courte (ARSH) avec une faible toxicité. Ici, un protocole détaillé pour la création des pseudoislets humains après la transduction lentivirale utilisant deux plaques multiwell disponibles dans le commerce est décrit. Le protocole peut être facilement exécuté et permet une régulation efficace des gènes et l’évaluation du dynamisme de la sécrétion d’insuline à l’aide de cellules d’înets humains. Ainsi, les pseudoislets humains avec la modulation médiée de gène lentiviral fournissent un modèle puissant et polyvalent pour évaluer la fonction de gène dans les cellules humaines d’îlots.

Introduction

La perte de masse cellulaire bêta fonctionnelle est la pathologie centrale pour le diabète de type 1 et de type 2¹. Alors que les cellules bêta sont les producteurs d’insuline dans les îlots pancréatiques, la communication entre les cellules bêta et les cellules non bêta joue un rôle critique dans la régulation de la sécrétion d’insuline². En outre, la dysrégulation de la sécrétion de glucagon contribue à l’hyperglycémie dans le diabète³. Ainsi, il y a un grand intérêt à moduler l’expression génique des cellules dans les îlots pancréatiques pour aborder le mécanisme derrière le développement du dysfonctionnement d’îlots dans le diabète. Une variété d’approches comprenant des souris transgéniques sont disponibles pour moduler l’expression de gène des îlots de souris. Cependant, les îlots humains et de souris montrent l’innervation distincte, la distribution cellulaire, le rapport de bêta aux cellules alpha, et la réponse aux sécréagogues⁴. Par conséquent, l’évaluation directe de la fonction génique dans les îlots humains est extrêmement importante pour comprendre la pathophysiologie des îlots pancréatiques humains.

Le vecteur adénoviral est le vecteur viral le plus largement utilisé pour transduire les îlots pancréatiques in vitro en raison de la forte efficacité de la transduction dans les cellules non-divisantes. Cependant, l’adénovirus ne pénètre pas efficacement au cœur des îlots, en particulier dans les îlots humains⁵, et est cytotoxique à fortes doses⁶. En comparaison, le vecteur lentiviral est moins cytotoxique et délivre des gènes exogènes de façon permanente dans le chromosome des cellules post-mitotiques, ce qui en fait un véhicule largement testé pour la thérapie génique⁷. Cependant, la capacité du lentivirus à pénétrer le noyau des îlots humains intacts est également limitée, nécessitant ainsi une dispersion partielle par digestion enzymatique pour augmenter l’efficacité de la transduction⁸. La mise en garde avec la dispersion des îlots humains intacts est l’interruption de la communication cellule-cellule et cellule-matrice,qui compromet la régulation dynamique de la sécrétion d’insuline critique pour le maintien de l’homéostasie de glucose chez l’homme 9. Ainsi, il a été difficile d’évaluer l’impact de la modulation des gènes sur la régulation dynamique de la fonction des îlots dans un modèle d’îlots humains.

On sait que les cellules des îlots dispersés des îlots humains et des rongeurs se réagroupent de façon autonome en structures semblables à des îlots appelées « pseudoislets ». Pseudoislets montrent la distribution des cellules bêta et non bêta similaire aux îlots indigènes^10,11. En outre, après la culture à long terme, les îlots indigènes perdent progressivement la sécrétion robuste d’insuline de première phase^5,10,11,12. Pourtant, les pseudoislets ont démontré une meilleure conservation de la sécrétion d’insuline de première phase en réponse au glucose comparé aux îlots indigènes après la même période de culture^5. En plus d’avoir une meilleure conservation de la sécrétion d’insuline, la réagrégation contrôlée par la taille des cellules des frayons humains dans les plaques à faible attachement¹¹ offre une fenêtre d’opportunité pour introduire des vecteurs de lentivirus avant leur réaggrégement dans pseudoislets. Plusieurs études ont démontré l’utilité des pseudoislets combinés à la transduction médiée par lentiviral. Caton et coll.¹³ ont signalé que l’introduction de la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant le lentivirus avait peu d’effet sur la sécrétion d’insuline tout en atteignant l’expression homogène du GFP dans les pseudoislets de rat comparés au contrôle non-infecté. Ils ont également démontré l’effet spécifique de différentes connexines sur la sécrétion d’insuline en surexprimant connexins 32, 36, et 43 par l’intermédiaire de lentivirus^13. Les pseudoislets humains préparés avec une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits disponible dans le commerce ont démontré que la surexpression par le facteur de transcription SIX3 améliore la sécrétion d’insuline évaluée par incubation statique¹⁴. Récemment, des pseudoislets humains préparés avec une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits ont été utilisés pour réguler la glucokinase par l’intermédiaire de l’ARN lentiviral à épingle à cheveux courte (arsh) comme preuve de principe pour montrer que la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose est réduite, tandis que La sécrétion d’insuline stimulée par KCl a été préservée⁵. L’étude a également démontré que les pseudoislets humains sont semblables aux îlots indigènes dans l’expression des gènes et les profils sécréteurs, soutenant davantage l’utilité des pseudoislets humains pour disséquer la régulation de la fonction d’îlots⁵. Bien que la perifusion n’ait pas été effectuée, une plaque de culture de micropuits bioengineered qui est récemment devenue commercialement disponible, a été également rapportée pour être compatible pour la transduction lentivirale et a produit des pseudoislets humains qui ont exhibé l’excellente insuline sécrétion in vitro et in vivo après la transplantation¹¹. Collectivement, la formation de pseudoislet humain combinée à la transduction lentivirale est une approche simple et efficace pour étudier la pathophysiologie humaine d’îlots, fournissant un outil valable pour effectuer des études mécanistes dans les îlots humains.

Dans le rapport actuel, un protocole pour former des pseudoislets humains transduiré s’est transduifait avec le lentivirus à l’aide de deux plates-formes disponibles dans le commerce, une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits et une plaque de culture de micropuits est présentée. Les deux permettent de modulation efficace de l’expression génique et de créer des pseudoislets humains compatibles pour les évaluations en aval, y compris l’incubation statique et la perifusion.

Protocol

Avant le début des études, une détermination de la recherche sur les sujets humains a été faite par la Commission d’examen institutionnel de l’Université de l’Iowa, qui a déterminé que l’étude ne répondait pas aux critères de recherche sur les sujets humains. Consultez la commission d’examen locale avant le début de l’étude afin de déterminer si la source des îlots et l’étude prévue doivent être approuvées au préalable. REMARQUE: En règle générale, 1 200…

Representative Results

La figure 1 illustre les étapes clés de la production de pseudoislets à l’aide d’une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits et d’une plaque de culture de micropuits. La figure 2a montre des changements séquentiaux dans la morphologie pendant la formation de pseudoislets à partir de 3 x 103 cellules d’îlots humains dans une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits. Monolayer ou amas lâches de cellules…

Discussion

Ici, un protocole détaillé pour générer des pseudoislets humains qui sont transducés par lentivirus à l’aide d’une plaque d’attachement ultra-faible de 96 puits ou d’une plaque de culture de micropuits est présenté. Pseudoislets ont été rapportés pour démontrer la morphologie et les fonctions sécrétrices semblables aux îlots humains indigènes et peuvent être cultivés pendant une période prolongée in vitro^{5,11,18</s…}

Materials

Anti-adherence rinsing solution	Stemcell technologies	7919
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 Series Type A2
cell strainer, 40 micrometer	Corning	431750
CMRL-1066	ThermoFisher	11530037
CO2 incubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i
conical centrifuge tube, 15 mL	VWR	89039-666
conical centrifuge tube, 50 mL	VWR	89039-658
fetal bovine serum	ThermoFisher	26140079
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent	ThermoFisher	15596026	Trizol
glutamine	ThermoFisher	25030164
Hemocytometer	Marien Feld	Neubauer-Improved Bright line
Human serum albumin	Sigma	A1653
inverted microscope	Fisher brand	11-350-119
microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 20
microcentrifuge tube, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
microwell culture plate	Stemcell technologies	34411	Aggrewell 400, 24 well
motor-driven pestle	GAMUT	#399X644
non-tissue culture treated dish, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713
PBS	ThermoFisher	14190250
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	10378016
Petri dish, 35 mm	Celltreat	229638
pipette, 5 mL	DOT Scientific,	667205B
pipette, 8-channel	VWR	#613-5253
pipette, 10 mL	VWR	667210B
pipette, P10	Denville	UEZ-P-10
pipette, P200	Denville	UEZ-P-200
pipette, P1000	Denville	UEZ-P-1000
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture	Sigma	A6965	Accutase
reagent reservoir, 50 mL	VWR	89094-680
reversible strainer, 37 micrometer	Stemcell technologies	27251
swing bucket plate centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-14R
swing bucket rotor	Beckman Coulter	SX4750A
tuberculin syringe, 1 mL	BD	309659
ultra low attachment microplate, 96 well	Corning	4515