לנטינגינה ג'ין מתווכת השתקה האדם פסאודו איון מוכן לוחות מצורף נמוך
Summary
פרוטוקול כדי ליצור גנים שונה האדם מדומה מפוזרים תאים איון האדם התפזרו על ידי וירוס לנשיאת RNA קצר (מרין) מוצג. פרוטוקול זה מנצל את כלי האנזים והתרבות הזמינים, ניתן לבצע בקלות, והוא מייצר מדומה מבחינה גנטית מדומה המתאים ללימודים פונקציונליים ומורפולוגיים.
Abstract
כלים גנטיים שונים זמינים לווסת גנים באיים הלבלב של מכרסמים כדי לנתח פונקציה של גנים איון למחקר סוכרת. עם זאת, הנתונים שהושגו מתוך איולי מכרסמים הם לעתים קרובות לא לשכפל במלואו או ישים לאיים האנושיים בשל הבדלים ידועים במבנה איון ותפקוד בין המינים. כיום, טכניקות הזמינות כדי לתמרן ביטוי הגנים של האיים האנושיים מוגבלים מאוד. מבוא של הטרנסגנים אל איונים שלמים על ידי אדנווירוס, פלסמיד, ו פורוזימטר לעתים קרובות סובל מיעילות נמוכה רעילות גבוהה. יעילות נמוכה היא בעייתית במיוחד במחקרים להוריד גנים באיונים שלמים, אשר דורשים יעילות גבוהה. ידוע כי התאים הפזורים בתוך הפיזור מחדש התפזרו בתרבות היוצרים הספרואידים שנקרא פסבדו. גודל מבוקר צבירה מחדש של תאים איון האדם יוצר מדומה כי לשמור על הפרשה דינמית בשלב הראשון אינסולין לאחר תרבות ממושכת ולספק חלון כדי להציג ביעילות את ה-RNA הקצר ויראלי (שרין) עם רעילות נמוכה. כאן, פרוטוקול מפורט ליצירת הפסבדו האנושי לאחר התמרה ויראלית באמצעות שתי צלחות מסחריות הזמינות בשני הלוחות מתוארות. הפרוטוקול ניתן לבצע בקלות ומאפשר להוריד יעיל של גנים והערכה של דינמיות של הפרשת אינסולין באמצעות תאים איון האדם. כך, מדומה אנושי עם אפנון גנטית מתווכת בתיווך לספק מודל רב עוצמה ורב תכליתי כדי להעריך את תפקוד הגנים בתוך תאי איון האדם.
Introduction
ההפסד של מסה תא ביתא פונקציונלי הוא הפתולוגיה המרכזית עבור שני סוג 1 וסוכרת סוג 21. בעוד תאי ביתא הם המפיקים של האינסולין באיים הלבלב, תקשורת בין תאי ביתא ותאים שאינם ביתא ממלא תפקיד קריטי בוויסות הפרשת האינסולין2. בנוסף, דיסתקנה של הפרשת גלוקגון תורמת להירגליקמיה בסוכרת3. כך, יש עניין חזק לווסת את הביטוי הגנטי של תאים בתוך איונים הלבלב כדי לטפל במנגנון מאחורי התפתחות של התפקוד של איון בסוכרת. מגוון רחב של גישות כולל עכברים טרנסגניים זמינים כדי לווסת את הביטוי הגנטי של איונים של העכבר. עם זאת, איונים אנושיים ועכברים להראות אינבציה שונה, התפלגות התא, היחס של ביתא לתאי אלפא, ואת התגובה הסוד4. לכן, הערכה ישירה של הפונקציה גנטי באיים האנושיים הוא חשוב מאוד להבנת הפתופסולוגיה של איולי הלבלב האנושי.
וקטור אדנונגיפי הוא וקטור ויראלי הנפוץ ביותר כדי לשנות את איולי הלבלב בחוץ בגלל היעילות הגבוהה של התמרה בתאים שאינם מפרידים. עם זאת, אדנווירוס לא לחדור לליבה של איונים ביעילות, במיוחד באיים האנושיים5, ו ציטוטוקסינים במינון גבוה6. יחסית, וקטור לנטינגיל הוא פחות ציטוטוקסיני ומספק גנים אקסוגניים לצמיתות לתוך כרומוזום של התאים post-mitotic, מה שהופך אותו רכב נבדק נרחב עבור טיפול גנטי7. עם זאת, את היכולת של הנגיף כדי לחדור את הליבה של איים אנושיים שלמים הוא גם מוגבל, ובכך דורשים פיזור חלקי על ידי העיכול אנזימטי כדי להגביר את יעילות התמרה8. האזהרה עם הפיזור של איים אנושיים שלמים היא ההפרעה של תא תא ותקשורת תא מטריקס, אשר מתפשר על הרגולציה הדינמית של הפרשת אינסולין קריטית לתחזוקת הומאוסטזיס גלוקוז בבני אדם9. לכן, זה כבר מאתגר להעריך את ההשפעה של אפנון גנטי על הרגולציה הדינמית של הפונקציה איון במודל של איונים אנושיים.
זה כבר ידוע כי מפוזרים תאים איון מ בני אדם מכרסמים באופן עצמאי מחדש לתוך מבנים כמו איון שנקרא “פסבדו”. פסאודו איים להראות ביתא ולא התפלגות תא ביתא דומה הילידים10,11. בנוסף, לאחר תרבות ארוכת טווח, האיים המקומיים מאבדים בהדרגה את הפרשת האינסולין הראשונית בשלב הראשון5,10,11,12. עם זאת, פסבדו-מוח הפגינו שימור טוב יותר של הפרשת האינסולין בשלב הראשון בתגובה לגלוקוז לעומת איונים מקומיים לאחר אותה תקופה של תרבות5. בנוסף לשימור טוב יותר של הפרשת אינסולין, לצבור מבוקר גודל של תאים איון האדם בלוחות מצורף נמוך11 מספק חלון של הזדמנות להציג וקטורים וירוס לפני הצבירה שלהם לתוך . מאוד מאיים מספר מחקרים הוכיחו את כלי השירות של הפסבדו בשילוב עם התמרה מתווכת. Caton ואח ‘13 דיווחו כי המבוא של חלבון פלורסנט ירוק (gfp) הביעה הבעה וירוס היתה השפעה קטנה על הפרשת אינסולין תוך השגת ביטוי הומוגנית של gfp ב מדומה לחולדה לעומת שליטה לא נגוע. הם גם הפגינו את ההשפעה הספציפית של connexins שונים על הפרשת אינסולין על ידי הבעת היתר connexins 32, 36, ו 43 באמצעות הנגיף13. מדומה האנושי הכין עם מסחרית זמין 96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת הראו כי הבעה ויראלי-מתווכת הביטוי של שעתוק גורם SIX3 משפר את הפרשת האינסולין המוערך על ידי דגירה סטטי14. לאחרונה, מדומה של האדם שהוכן בלוח ההחזקות ה96-והטוב אולטרה-נמוך, שימשו לצמצום השימוש בגלוקינאז דרך רנ א קצר ויראלי (שרין) כהוכחה לעיקרון כדי להראות כי הפרשת אינסולין מגורה מופחתת, בעוד הפרשת אינסולין מאולצת נשמרה ב-5. המחקר הראה גם כי מדומה האנושי דומים לאיונים מקומיים בביטוי גנים ופרופילי הפרשה, תמיכה נוספת של השירות של פסאודו האדם כדי לנתח את הרגולציה של הפונקציה איון5. למרות הפריזיה לא בוצעה, צלחת תרבות המיקרוגל ביולוגי שלאחרונה הפך להיות זמין מסחרית, דווח גם להיות תואם התמרה ויראלית והפיק מדומה ומיוצר האנושי הציג אינסולין מעולה הפרשה במבחנה ובvivo לאחר השתלת11. באופן קולקטיבי, היווצרות מדומה האדם בשילוב עם התמרה ויראלית היא גישה פשוטה ויעילה כדי לחקור את האי האנושי פתופסולוגיה, מתן כלי רב ערך לבצע מחקרים מכניסטיים באיונים אנושיים.
בדוח הנוכחי, פרוטוקול ליצירת מגוון מדומה של האדם עם וירוס באמצעות שתי פלטפורמות זמינות מסחרית, a 96-היטב אולטרה מצורף לוחית החיבור ולוח תרבות המיקרוגל מוצג. שניהם להשיג אפנון יעיל של ביטוי גנים וליצור מדומה אנושי התואמים הערכות במורד הזרם כולל דגירה סטטי הפריזיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, פרוטוקול מפורט כדי ליצור מדומה האנושי כי הם התמרה על ידי וירוס באמצעות מ96-ובכן אולטרה נמוך מצורף צלחת או לוחית התרבות מוצג. פסאודו איים דיווחו להפגין מורפולוגיה ופונקציות הפרשה דומה האיים האנושיים הילידים יכולים להיות מתורבתים לזמן ממושך בתוך מבחנה5,11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת כספית על ידי מכוני הבריאות הלאומיים לY.I. (R01-DK090490) והאגודה האמריקנית לסוכרת Y.I. (1-17-IBS-132). דביק ja ו-Y.I. נתמכים על ידי המרכז לחקר הסוכרת של הנשרים מסדר אחווה. א יהושע נתמך על ידי המכון הלאומי של מענק הכשרה בריאות (T32NS45549). מחברים מנוצל האדם הלבלב איונים שסופקו על ידי התוכנית הפצה משולבת של איון NIDDK במימון (IIDP) בעיר של תקווה (2UC4DK098085).
Materials
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
References
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
