Utilisation de Microtiter Dish Radiolabeling pour plusieurs mesures in vivo d'Escherichia coli (p)ppGpp Suivi par thin Layer Chromatography
Summary
La croissance des cultures bactériennes radio-étiquetées dans les plats de microtiter facilite l’échantillonnage à haut débit qui permet de multiples essais techniques et biologiques de répétition de l’abondance des piscines de nucléotides, y compris celle de (p)ppGpp. Les effets des transitions de croissance provoquées par les sources de stress physiologique ainsi que la récupération du stress peuvent être surveillés.
Abstract
Le (p)ppGpp nucléotide fonctionne comme un régulateur mondial dans les bactéries en réponse à une variété de stress physique et nutritionnel. Il a un début rapide, en secondes, ce qui conduit à l’accumulation de niveaux qui approchent ou dépassent ceux des piscines GTP. L’inversion du stress entraîne une disparition rapide de (p)ppGpp, souvent avec une demi-vie de moins d’une minute. La présence de (p)ppGpp entraîne des altérations de l’expression et du métabolisme des gènes cellulaires qui contrecarrent les effets néfastes du stress. Les bactéries Gram-négatives et Gram-positives ont des mécanismes de réponse différents, mais les deux dépendent de la concentration (p)ppGpp. Quoi qu’il en soit, il est nécessaire de surveiller simultanément de nombreuses cultures bactériennes radio-étiquetées à intervalles de temps qui peuvent varier de 10 secondes à des heures pendant les périodes critiques de transition du stress. Ce protocole répond à ce défi technique. La méthode tire parti des incubateurs de microtiter à température et à shaker qui permettent une surveillance parallèle de la croissance (absorption) et un échantillonnage rapide des cultures uniformément étiquetées au phosphate pour résoudre et quantifier les piscines de nucléotides par chromatographie à couches minces sur la cellulose de l’Ile-du-Prince-Édouard. De petites quantités d’échantillons sont nécessaires pour de multiples répliques techniques et biologiques d’analyses. Les transitions de croissance complexes, telles que la croissance diauxic et les taux de rotation rapides (p)ppGpp peuvent être quantitativement évaluées par cette méthode.
Introduction
Le (p)ppGpp second messenger est un régulateur mondial qui module l’expression d’un grand nombre de gènes, y compris les gènes pour synthétiser les ribosomes et les acides aminés1,2. Bien que initialement découvert dans Escherichia coli3, (p)ppGpp peut être trouvé à la fois gram positive et Gram bactéries négatives ainsi que dans les chloroplastes végétaux4,5. Pour E. coli et d’autres bactéries Gram-négatives, (p)ppGpp interagit directement avec la polymérase d’ARN à deux sites différents6,7,8. Dans Gram positive, (p)ppGpp inhibe l’abondance du GTP, qui est sentie par CodY, une protéine liant GTP avec des motifs de reconnaissance de l’ADN spécifiques aux gènes qui conduisent à la régulation9,10. (p)ppGpp s’accumule en réponse à la famine pour différents nutriments et conditions de stress, résultant en une croissance lente et des ajustements de l’expression des gènes pour permettre l’adaptation au stress11,12.
La quantité nette de ppGpp accumulée reflète un équilibre entre les activités de syntase et d’hydrolase. Dans E. coli RelA est une synthétase forte et SpoT est bifonctionnel, avec une forte hydrolase et une faible synthèse, dont chacun pourrait être réglementé différemment d’une manière dépendante du stress. La forte synthétase RelA est activée lorsque la disponibilité de l’ARNt chargé codon spécifié lié au site ribosomal A quand il ne parvient pas à suivre les exigences de synthèse des protéines13,14,15. La faible synthétase SpoT (p)ppGpp est activée tandis que l’hydrolase forte (p)ppGpp est inhibée en réponse à d’autres conditions de stress et par d’autres mécanismes. Dans certaines conditions, les protéines telles que ACP ou Rsd peuvent se lier à SpoT, qui modifient également l’équilibre entre l’hydrolyse et la synthèse16,17. Dans Gram positifs, la synthèse et l’hydrolyse reflètent un équilibre plus complexe entre une seule protéine relA SpoT homolog (RSH) avec de fortes activités de synthèse et d’hydrolyse ainsi que de plus petites hydrolases et/ou des synthèses12.
Les nucléotides (p)ppGpp ont d’abord été découverts comme des taches inhabituelles étiquetées 32P qui sont apparues sur les autoradiogrammes des chromatogrammes à couches minces (TLC) lors d’une réponse rigoureuse induite par la famine d’acides aminés3. Des protocoles d’étiquetage plus détaillés ont été examinés 18. Le protocole décrit ici (figure 1) est une modification de ces protocoles qui permet de surveiller la croissance de plusieurs échantillons sur des plaques de microtiter. Cela facilite de multiples estimations biologiques et techniques des changements d’abondance (p)ppGpp et a été initialement développé pour des études de décalages diauxic19. L’étiquetage de (p)ppGpp avec 32P et la détection par TLC permet également de mesurer les taux de dégradation (p)ppGpp. Des méthodes alternatives ont été développées pour déterminer (p)ppGpp niveaux tels que la spectrométrie de masse, HPLC20, chimiocapteurs fluorescents21,22, et les fusions de gènes GFP aux promoteurs touchés par ppGpp23, 24. Les chimiosenseurs fluorescents ont actuellement une utilisation limitée en raison de petits décalages spectrals après la liaison ppGpp ainsi que des problèmes de distinction entre ppGpp et pppGpp21. Cette méthode est efficace pour détecter (p)ppGpp in vitro, mais pas dans les extraits cellulaires. Les méthodes impliquant HPLC ont été améliorées20, mais nécessitent un équipement coûteux et ne sont pas bien adaptés à la haute débit. Enfin, les fusions GFP peuvent donner une estimation de l’activation ou de l’inhibition dépendante de ppGpp, mais ne mesurent pas ppGpp lui-même. Bien que chacune de ces méthodes alternatives soit utile, elle nécessite un équipement coûteux ou un temps pratique important, ou elles ne sont pas autrement propices à l’échantillonnage cinétique multiple et au traitement ultérieur. Avec la méthode décrite ici, 96 échantillons peuvent être appliqués à six plaques TLC dans environ 20 min (18 échantillons par plaque), résolus par le développement de TLC en moins de quelques heures, avec des données quantitatives obtenues après plusieurs heures ou pendant la nuit, selon l’étiquetage intensité.
Protocol
Representative Results
Discussion
La réalisation d’un étiquetage presque uniforme des cellules est une étape critique pour ce protocole. Par conséquent, l’utilisation de médias définis, tels que moPS ou Tris media, est cruciale pour permettre la variation des concentrations de phosphate porteur et de l’activité spécifique. Les supports tampons de phosphate, tels que M9 ou le média A, ne peuvent pas être utilisés. La plupart des médias non définis contiennent des quantités variables de phosphate, comme la LB, le tryptone et les acides casami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
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