Ince katman Kromatografi takip Escherichia coli (p) ppGpp çoklu In vivo ölçümleri Için mikrotiter bulaşık Radiolabeling kullanma
Summary
Radyoaktif bakteriyel kültürlerin mikrotiter yemeklerde büyümesi, (p) ppgpp dahil olmak üzere birden çok teknik ve biyolojik çoğalan nükstrütit havuzu zenginliğini sağlayan yüksek verimlilik örneklemesini kolaylaştırır. Fizyolojik stres kaynakları tarafından provoke edilen büyüme geçişleri ve stres kurtarma etkileri izlenebilmektedir.
Abstract
Çeşitli fiziksel ve beslenme stresine yanıt olarak bakterilerde küresel bir regülatör olarak (p) ppGpp nükreotid fonksiyonları. Bu, GTP havuzlarının yaklaşması veya aşan düzeylerin birikmesine yol açan, saniyeler içinde hızlı bir başlangıça sahiptir. Stres ters durumlar (p) ppgpp, genellikle bir dakikadan az bir yarı ömrü ile hızlı bir ortadan kalkması. (P) ppGpp varlığı, stres zararlı etkileri karşı hücresel gen ifade ve metabolizma değişiklikler sonuçlanır. Gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerin farklı reaksiyon mekanizmaları vardır, ancak her ikisi de (p) ppGpp konsantrasyonuna bağlıdır. Herhangi bir durumda, kritik stres geçiş dönemlerinde 10 saniyeden saate kadar değişebilir zaman aralıklarında birçok radyoaktif bakteriyel kültürler aynı anda izlemek için bir ihtiyaç vardır. Bu protokol bu teknik sorunu giderir. Yöntem, büyüme (emici) ve homojen fosfat-radiolabeled kültürlerin hızlı örnekleme paralel izlenmesi izin sıcaklık ve Shaker kontrollü mikrotiter çanak inküküperlerin yararlanmak ve nükleyici havuzlar tarafından quantitate PEI-selüloz üzerinde ince katmanlı Kromatografi. Analizlerin birden fazla teknik ve biyolojik çoğaltır için küçük miktarlarda örnek gereklidir. Diauxic büyüme ve hızlı (p) ppGpp ciro oranları gibi kompleks büyüme geçişleri bu yöntem ile niceci olarak değerlendirilebilir.
Introduction
(P) ppgpp ikinci haberci ribozomlarda ve amino asitler synthesizer sentezlemek için genler de dahil olmak üzere genler çok sayıda ifade modülasyonlu bir küresel regülatör olduğunu1,2. Başlangıçta Escherichia coli3‘ te keşfedilen olsa da, (p) ppgpp hem gram pozitif hem de gram negatif bakterilerin yanı sıra Plant kloroplast4,5‘ te bulunabilir. E. coli ve diğer gram-negatif bakteriler için, (p) ppgpp iki farklı sitede RNA polimeraz ile doğrudan etkileşime girer6,7,8. Gram pozitiplerinde, (p) ppgpp, CodY tarafından bilindiği GTP bereket inhibe, yönetmeliğine yol gen-spesifik DNA tanıma motifleri ile bir GTP-bağlayıcı protein9,10. (p) ppgpp farklı besin ve stres koşulları için açlık yanıt olarak birikir, yavaş büyüme ve gen ifadesi ayarlamaları sonuçlanan stres adaptasyon sağlamak için11,12.
Net miktar ppgpp birikmiş sentetaz ve hidrolaz etkinlikleri arasında bir denge yansıtır. E. coli rela güçlü bir sentetaz ve SpoT, güçlü bir hidrolaz ve zayıf bir sentetaz ile, her biri farklı bir stres bağımlı şekilde düzenlenmiş olabilir bifetit olduğunu. Güçlü rela sentetaz, Codon tarafından belirlenen şarj edilen tRNA ‘nın, protein sentezi13,14,15taleplerini karşılamak için başarısız olduğunda ribozomal bir siteye bağlı olduğu zaman etkinleştirilir. Zayıf nokta (p) ppgpp sentetaz, güçlü (p) ppgpp hidrolaz diğer stres koşullarına ve diğer mekanizmalara yanıt olarak engellenmiş durumdayken etkinleştirilir. Bazı koşullar altında, ACP veya RSD gibi proteinler, aynı zamanda hidroliz ve sentez16,17arasındaki dengeyi değiştirmek SpoT bağlayabilirsiniz. Gram pozitişlerinde sentez ve hidroliz, güçlü sentez ve hidroliz faaliyetlerinin yanı sıra daha küçük Hidrolazlar ve/veya senthetaz12ile tek bir rela SpoT homolog (RSH) proteini arasında daha karmaşık bir denge yansıtır.
(P) ppGpp nükleotidler ilk amino asit açlık3tarafından indüklenen sıkı bir yanıt sırasında ince katmanlı kromatogram (TLC) autoradiograms ortaya çıkan olağandışı 32p etiketli noktalar olarak keşfedilen. Daha ayrıntılı etiketleme protokolleri 18değerlendirildi. Burada açıklanan protokol (Şekil 1), mikrotiter plakaları üzerinde birden fazla numunenin gelişimini izlemeyi sağlayan bu protokollerin bir değişikliğini oluşturmaktadır. Bu (p) ppGpp bolluk değişiklikleri birden fazla biyolojik ve teknik tahminler kolaylaştırır ve başlangıçta diauxic vardiya çalışmaları için geliştirilmiştir19. 32p ve TLC tarafından tespit edilen (p) ppgpp etiketlemesi de (p) ppgpp azalma oranlarının ölçülmesine olanak tanır. PpGpp23‘ ün etkilendiği organizatörler için kütle spektrometresi, HPLC20, floresan chemosensors21,22ve Gfp gen Fusions gibi ppgpp düzeylerini belirlemek üzere alternatif yöntemler geliştirilmiştir. 24. floresan chemosensors Şu anda sınırlı bir kullanım nedeniyle ppgpp ve pppgpp21arasında ayırt sorunları bağlama sonra küçük spektral vardiya vardır. Bu yöntem algılamak için etkilidir (p) ppGpp in vitro, ancak hücresel özler. HPLC içeren yöntemler20 geliştirilmiş ama pahalı ekipman gerektirir ve iyi yüksek aracılığıyla-put adapte değildir. Son olarak, GFP Fusions ppGpp bağımlı aktivasyon veya inhibisyonu bir tahmin verebilir, ancak ppGpp kendisini ölçmek değil. Bu alternatif yöntemlerin her biri değerli iken, onlar pahalı ekipman veya önemli Hands-on zaman gerektirir, ya da aksi takdirde birden fazla kinetik örnekleme ve sonraki işleme için uygun değildir. Burada açıklanan yöntemle, 96 numuneler yaklaşık 20 dakika içinde (plaka başına 18 numune) altı TLC plakasına uygulanabilir, TLC gelişimi tarafından birkaç saatten daha az bir süre içinde çözülebilir, etiketlemeye bağlı olarak birkaç saat veya gece sonra elde edilen nicel verilerle Yoğun -luğu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücrelerin yakın Tekdüzen etiketleme ulaşmak bu protokol için kritik bir adımdır. Bu nedenle, MOPS veya Tris medya gibi tanımlanmış medya kullanımı, taşıyıcı fosfat konsantrasyonları ve belirli aktivite varyasyonu sağlamak için çok önemlidir. M9 veya medya A gibi fosfat arabelleğe alınmış medya kullanılamaz. Çoğu tanımlanamayan medya, £, Tripton ve kasaminoz asitleri gibi değişken miktarlarda fosfat içerir. Fosfat izotopu 33p, 32p için yerine konulabilir daha zayıf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Intramural araştırma programı, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve ınsan gelişimi, NıH destekleniyordu.
Materials
| (NH4)6(MO7)24 | Fisher Scientifics | A-674 | |
| Autoradiography film | Denville scientific inc. | E3218 | |
| CaCl2 | J.T.Baker | 1-1309 | |
| Chloramphenicol | RPI | C61000-25.0 | |
| CoCl2 | Fisher Scientifics | C-371 | |
| CuSO4 | J.T.Baker | 1843 | |
| FeSO4 | Fisher Scientifics | I-146 | |
| Formic acid | Fisher Biotech | BP1215-500 | |
| Glucose | Macron | 4912-12 | |
| H3BO4 | Macron | 2549-04 | |
| H3PO4 | J.T.Baker | 0260-02 | |
| K2SO4 | Sigma | P9458-250G | |
| KH2PO4 | Fisher Biotech | BP362-500 | |
| L-Valine | Sigma | V-6504 | |
| MgCl2 | Fisher Scientifics | FL-06-0303 | |
| Microplate reader Synergy HT | Biotek | Synergy HT | |
| MnCl2 | Sigma | M-9522 | |
| MOPS | Sigma | M1254-1KG | |
| Na2HPO4 | Mallinckrodt | 7892 | |
| NaCl | J.T.Baker | 3624-01 | |
| NaH2PO4 | Mallinckrodt | 7917 | |
| NH4Cl | Sigma | A0171-500G | |
| P-32 radionuclide, orthophosphoric acid in 1 mL water (5 mCi) | Perkin Elmer | NEX053005MC | |
| Storage phosphor screen | Kodak | So230 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Thiamine | Sigma | T-4625 | |
| TLC PEI Cellulose F | Merk-Millipore | 1.05579.0001 | |
| Tricine | RPI | T2400-500.0 | |
| Typhoon 9400 imager | GE Healthcare | ||
| ZnSO4 | Fisher Scientifics | Z-68 |
References
- Cashel, M., Gentry, D., Hernandez, V., Vinella, D. The stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. , 1458-1489 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nyström, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13 (5), 236-242 (2005).
- Cashel, M., Gallant, J. Two Compounds implicated in the Function of the RC Gene of Escherichia coli. Nature. 221 (5183), 838-841 (1969).
- Braeken, K., Moris, M., Daniels, R., Vanderleyden, J., Michiels, J. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Atkinson, G. C., Tenson, T., Hauryliuk, V. The RelA/SpoT homolog (RSH) superfamily: distribution and functional evolution of ppGpp synthetases and hydrolases across the tree of life. PloS One. 6 (8), e23479 (2011).
- Mechold, U., Potrykus, K., Murphy, H., Murakami, K. S., Cashel, M. Differential regulation by ppGpp versus pppGpp in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 41 (12), 6175-6189 (2013).
- Molodtsov, V., et al. Allosteric Effector ppGpp Potentiates the Inhibition of Transcript Initiation by DksA. Molecular Cell. 69 (5), 828-839 (2018).
- Ross, W., Sanchez-Vazquez, P., Chen, A. Y. Y., Lee, J. -. H. H., Burgos, H. L. L., Gourse, R. L. L. ppGpp Binding to a Site at the RNAP-DksA Interface Accounts for Its Dramatic Effects on Transcription Initiation during the Stringent Response. Molecular Cell. 62 (6), 811-823 (2016).
- Kriel, A., et al. Direct Regulation of GTP Homeostasis by (p)ppGpp: A Critical Component of Viability and Stress Resistance. Molecular Cell. 48 (2), 231-241 (2012).
- Kriel, A., et al. GTP dysregulation in Bacillus subtilis cells lacking (p)ppGpp results in phenotypic amino acid auxotrophy and failure to adapt to nutrient downshift and regulate biosynthesis genes. Journal of Bacteriology. 196 (1), 189-201 (2014).
- Potrykus, K., Cashel, M. p)ppGpp: still magical. Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
- Hauryliuk, V., Atkinson, G. C., Murakami, K. S., Tenson, T., Gerdes, K. Recent functional insights into the role of (p)ppGpp in bacterial physiology. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 298-309 (2015).
- Arenz, S., et al. The stringent factor RelA adopts an open conformation on the ribosome to stimulate ppGpp synthesis. Nucleic Acids Research. 44 (13), 6471-6481 (2016).
- Loveland, A. B., et al. Ribosome•RelA structures reveal the mechanism of stringent response activation. eLife. 5, e17029 (2016).
- Brown, A., Fernández, I. S., Gordiyenko, Y., Ramakrishnan, V. Ribosome-dependent activation of stringent control. Nature. 534 (7606), 277-280 (2016).
- Battesti, A., Bouveret, E. Acyl carrier protein/SpoT interaction, the switch linking SpoT-dependent stress response to fatty acid metabolism. Molecular Microbiology. 62 (4), 1048-1063 (2006).
- Lee, J. -. W., Park, Y. -. H., Seok, Y. -. J. Rsd balances (p)ppGpp level by stimulating the hydrolase activity of SpoT during carbon source downshift in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), E6845-E6854 (2018).
- Cashel, M. Detection of (p)ppGpp Accumulation Patterns in Escherichia coli mutants. Molecular Microbiology Techniques. 3, 341-356 (1994).
- Fernández-Coll, L., Cashel, M. Contributions of SpoT Hydrolase, SpoT Synthetase, and RelA Synthetase to Carbon Source Diauxic Growth Transitions in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. , (2018).
- Varik, V., Oliveira, S. R. A., Hauryliuk, V., Tenson, T. HPLC-based quantification of bacterial housekeeping nucleotides and alarmone messengers ppGpp and pppGpp. Scientific Reports. 7 (1), 11022 (2017).
- Rhee, H. -. W., et al. Selective Fluorescent Chemosensor for the Bacterial Alarmone (p)ppGpp. J. Am. Chem. Soc. 130 (3), 784-785 (2008).
- Wang, J., Chen, W., Liu, X., Wesdemiotis, C., Pang, Y. A Mononuclear Zinc Complex for Selective Detection of Diphosphate via Fluorescence ESIPT Turn-On. Journal of Materials Chemistry B. 2 (21), 3349-3354 (2014).
- Pokhilko, A. Monitoring of nutrient limitation in growing E. coli: a mathematical model of a ppGpp-based biosensor. BMC Systems Biology. 11 (1), 106 (2017).
- Funabashi, H., Mie, M., Yanagida, Y., Kobatake, E., Aizawa, M. Fluorescent monitoring of cellular physiological status depending on the accumulation of ppGpp. Biotechnology Letters. 24 (4), 269-273 (2002).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Peselis, A., Serganov, A. ykkC riboswitches employ an add-on helix to adjust specificity for polyanionic ligands. Nature Chemical Biology. 14 (9), 887-894 (2018).
- Oki, T., Yoshimoto, A., Sato, S., Takamatsu, A. Purine nucleotide pyrophosphotransferase from Streptomyces morookaensis, capable of synthesizing pppApp and pppGpp. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 410 (2), 262-272 (1975).
- Travers, A. A. ppApp alters transcriptional selectivity of Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Letters. 94 (2), 345-348 (1978).
- Bruhn-Olszewska, B., et al. Structure-function comparisons of (p)ppApp vs (p)ppGpp for Escherichia coli RNA polymerase binding sites and for rrnB P1 promoter regulatory responses in vitro. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1861 (8), 731-742 (2018).
