Een muis model van vasculaire Heterotopic milt transplantatie voor het bestuderen van milt celbiologie en transplantatie immuniteit

Summary

Dit protocol Details van de chirurgische stappen van een muismodel van vasculaire heterotopic milt transplantatie, een technisch uitdagend model dat kan dienen als een krachtig instrument in het bestuderen van het lot en de levensduur van de Miltcellen, de mechanismen van verschillende milt cel populaties in progressie van de ziekte, en transplantatie immuniteit.

Abstract

De milt is een unieke lymfe orgel dat een cruciale rol speelt in de homeostase van het immuunsysteem en hematopoietische systemen. Patiënten die splenectomie hebben ondergaan, ongeacht neerslaan oorzaken zijn vatbaar voor een overweldigende post-splenectomie infectie te ontwikkelen en de ervaring verhoogde Risico’s van diepe veneuze trombose en maligniteiten. Onlangs, epidemiologische studies aangegeven dat splenectomie zou kunnen worden geassocieerd met het optreden van hart-en vaatziekten, wat suggereert dat fysiologische functies van de milt nog niet volledig zijn erkend. Hier introduceren we een muismodel van vasculaire heterotopic milt transplantatie, die niet alleen kan worden gebruikt om de functie en gedrags-activiteit van milt immuun cel subsets in verschillende biologische processen studie, maar ook kan een krachtig instrument om te testen het therapeutische potentieel van milt transplantatie bij bepaalde ziekten. De belangrijkste chirurgische stappen van dit model zijn donor milt oogst, het verwijderen van de ontvanger inheemse milt, en milt Graft revascularisatie. Met behulp van congenic muis stammen (bijv. muizen met CD 45.1/CD 45.2 achtergronden), hebben we opgemerkt dat na syngeneic transplantatie, zowel donor-afgeleide milt lymfocyten en myeloïde cellen gemigreerd uit de Graft zo vroeg post-operatieve dag 1, gelijktijdig met de instroom van meerdere soorten ontvangers cellen, waardoor het genereren van een unieke hersenschim.  Ondanks de relatief uitdagende technieken, kan deze procedure worden uitgevoerd met > 90% slaagkans. Dit model maakt het bijhouden van het lot, levensduur, en de functie van splenocyten tijdens steady state en in een ziekte setting na een milt transplantatie, waardoor het aanbieden van een grote kans om de duidelijke rol voor de milt afgeleide immuun cellen te ontdekken in verschillende ziekteprocessen.

Introduction

De milt is het grootste secundaire lymfe orgaan in het lichaam en is kritiek in de immune en hematopoietische systemen. De functies worden voornamelijk uitgevoerd door twee morfologisch verschillende compartimenten, de rode pulp en de witte pulp¹. De rode pulp is een drie-dimensionale trabekelnetwerk van veneuze sinussen en milt koorden die bestaan uit reticulaire vezels, reticulaire cellen, en de bijbehorende macrofagen. Deze unieke structuur kan de rode pulp op te treden als een effectief bloed filter dat buitenlandse materialen en oude of beschadigde bezinkingen verwijdert. De witte pulp bevat follikels, marginale zone, en de periarteriolar lymfe scheden (PALS) en is een belangrijke site voor antigeen overvulling en verwerking, lymfocyten automatisch besturen, transformatie, proliferatie, en rijping². Niettemin, de milt is algemeen beschouwd als een uitvoerbaar orgaan, omdat andere lymfeorganen, zoals lymfeklieren, kan ook uitvoeren van een aantal van haar functies en het verlies van milt niet meestal leiden tot de dood. Splenectomie is daarom op grote schaal uitgevoerd als een therapeutische methode voor patiënten met milt letsel of goedaardige hematologische ziekten³. Echter, patiënten met splenectomie geconfronteerd met een aantal lange-termijn complicaties. Bacteriële infecties zijn de best-erkende complicaties van splenectomie^4,5. Onlangs heeft de overweldigende post-splenectomie sepsis is erkend als een intensieve complicatie van splenectomie geassocieerd met een hoge mortaliteit⁶. Bovendien blijkt uit recente epidemiologische studies dat splenectomie kan worden geassocieerd met het optreden van hart-en vaatziekten, wat suggereert dat verdere fysiologische functies van de milt nog moeten worden verkend^7,8.

Zowel milt transplantatie en milt allotransplantation zijn gebruikt in de kliniek. Momenteel, milt transplantatie door het implanteren van secties van milt weefsel in zakjes gemaakt in de grotere Omentum wordt beschouwd als de enige mogelijkheid voor het behoud van milt functie na traumatische splenectomie^9,10. Echter, de werkzaamheid van deze operatie is discutabel als post-chirurgie complicaties zoals aseptische necrose van de milt weefsel en kleine darmobstructie als gevolg van postoperatieve aanhechtingen kunnen optreden¹¹. Milt allotransplantation is betrokken bij multiviscerale transplantatie¹². Klinisch bewijs van multiviscerale transplantatie suggereert dat milt allotransplantation kan een beschermende rol spelen in kleine darm Allograft afwijzing zonder dat graft-versus-host Disease (GVHD)¹². Maar toch is de literatuur betreffende het gunstige effect van milt allotransplantation als component van multiviscerale transplantatie nog beperkt en de onderliggende mechanismen blijven worden bepaald. In 2006, Yair Reisner et al. gemeld dat transplantatie varken embryonale milt weefsel dat geen T-cellen heeft om muizen kon genezen hemofilie A, een genetische ziekte zonder dat GVHD¹³, ondersteuning van die milt transplantatie houdt therapeutische belofte in bepaalde ziekten. Daarom is er behoefte aan verder onderzoek naar het therapeutische potentieel van milt transplantatie.

De dierlijke modellen van milt transplantatie zijn waardevol om de niet gewaardeerde functie van de milt-afgeleide immune cellen in ziektevooruitgang te onderzoeken evenals het potentiële therapeutische effect van milt transplantatie te testen. Experimentele hele milt transplantatie modellen zijn gedocumenteerd sinds begin 1900, zoals beoordeeld door Cohen¹⁴. In 1969, Coburn Richard J. en Lee et al. gedetailleerd de techniek van milt transplantatie bij ratten^15,16. Meer recentelijk, Swirski FK et al. beschreven een muismodel van milt transplantatie¹⁷. Vergeleken met ratten modellen, Muismodellen van de milt transplantatie zijn aantrekkelijker te wijten aan de verschillende inherente voordelen. Bijvoorbeeld, door gebruik te maken van een muismodel, kunnen we toegang tot een expansieve verscheidenheid van reagentia die niet beschikbaar zijn voor die van Rat modellen. Bovendien, door het gebruik van congenic muizen (bijvoorbeeld muizen met CD 45.1/CD 45.2 achtergrond), een syngeneic milt transplantatie maakt het mogelijk om het lot, de levensduur en de functie van splenocyten¹⁸track. Gebaseerd op het werk van Swirski FK et al.¹⁷, hebben we dit vereenvoudigde en verbeterde Protocol van milt transplantatie in muizen verder vastgesteld. Het protocol hieronder beschreven combineert zowel betrouwbaarheid en haalbaarheid op een gestandaardiseerde wijze en kan worden gebruikt als een instrument om milt biologie en transplantatie immuniteit studie.

Protocol

Alle procedures en het gebruik van dieren in deze studie werden uitgevoerd volgens de protocollen goedgekeurd door de Northwestern University interne zorg en het gebruik Comite (DEC). In deze studie, 8 tot 10 week oude mannelijke CD 45.2 en CD 45.1 muizen (zowel op BALB/c achtergrond, van Jackson Laboratory) werden gebruikt als milt donoren en ontvangers, respectievelijk te creëren syngeneic milt transplantatie modellen. Alle dieren werden gehuisvest in de steriele omgeving in de dieren faciliteiten van de Northwestern …

Representative Results

De hele procedure van de muis milt transplantatie kan worden voltooid binnen 90 min door ervaren microchirurgen. Ons laboratorium heeft uitgevoerd meer dan 100 milt transplantaties bij muizen. Het succespercentage is meer dan 90%, zoals gedefinieerd door het voortbestaan van zowel de ontvanger muis en de milt Graft op post-operatieve dag (POD) 1 of POD 7 (onze studie eindpunt). Het voortbestaan van de milt Graft werd bevestigd door de macroscopische verschijning en stroming Cytometry anal…

Discussion

Overtuigend bewijs suggereert dat milt-afgeleide monocyten spelen een belangrijke rol in steriele inflammatoire processen zoals atherosclerose¹⁹, acute ischemische hersenen²⁰ of longschade¹⁸, evenals myocard I/R letsel en het verbouwen van^21,22,23. Deze rapporten benadrukken de ondererkenning rol van de milt bij veel chronische ziekten, waarvan hart-en vaatz…

Materials

Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955