Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

Summary

Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos de un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, un modelo técnicamente desafiante que puede servir como una herramienta poderosa en el estudio del destino y la longevidad de las células del bazo, los mecanismos de distinto bazo las poblaciones celulares en progresión de la enfermedad e inmunidad al trasplante.

Abstract

El bazo es un órgano linfoide único que desempeña un papel crítico en la la homeostasis de los sistemas inmunológico y hematopoyético. Los pacientes que se han sometido a una esplenectomía, independientemente de las causas desencadenantes, son propensos a desarrollar una infección de post-esplenectomía abrumadora y experimentan un mayor riesgo de trombosis venosa profunda y neoplasias malignas. Recientemente, los estudios epidemiológicos indicaron que la esplenectomía podría estar asociada a la aparición de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que las funciones fisiológicas del bazo aún no se han reconocido plenamente. Aquí, presentamos un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, que no sólo se puede utilizar para estudiar la función y la actividad conductual de los subconjuntos de células inmunitarias esplénica en diferentes procesos biológicos, sino que también puede ser una herramienta poderosa para probar el potencial terapéutico del trasplante de bazo en ciertas enfermedades. Los principales pasos quirúrgicos de este modelo incluyen la cosecha del bazo del donante, la extirpación del bazo nativo receptor y la revascularización del injerto del bazo. Utilizando cepas de ratón Congénicos (p. ej., ratones con fondos de CD 45.1/CD 45.2), observamos que después del trasplante singénico, los linfocitos esplénicos derivados de donantes y las células mieloide migraron del injerto tan pronto como el día 1 postoperatorio, concomitantemente con la afluencia de múltiples tipos de células destinatarias, generando así una quimera única.  A pesar de las técnicas relativamente desafiantes, este procedimiento se puede realizar con > 90% tasa de éxito. Este modelo permite rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos durante el estado estacionario y en un entorno de enfermedad después de un trasplante de bazo, ofreciendo así una gran oportunidad para descubrir el papel distintivo de las células inmunes derivadas del bazo en diferentes procesos de la enfermedad.

Introduction

El bazo es el órgano linfoide secundario más grande del cuerpo y es crítico en los sistemas inmunológico y hematopoyético. Sus funciones se llevan a cabo principalmente por dos compartimentos morfológicamente distintos, la pulpa roja y la pulpa blanca¹. La pulpa roja es una malla tridimensional de senos venosos y cuerdas esplénica que consisten en fibras reticulares, células reticulares y macrófagos asociados. Esta estructura única permite que la pulpa roja actúe como un filtro sanguíneo eficaz que elimina los materiales extraños y los eritrocitos viejos o dañados. La pulpa blanca incluye folículos, zona marginal y vainas linfoides periarteriolares (PALS) y es un sitio importante para la captura y procesamiento de antígeno, el homing de linfocitos, la transformación, la proliferación y la maduración². Sin embargo, el bazo se ha considerado comúnmente como un órgano prescindible porque otros órganos linfáticos, como los ganglios linfáticos, también pueden llevar a cabo algunas de sus funciones y la pérdida del bazo no suele conducir a la muerte. Por lo tanto, la esplenectomía se ha realizado ampliamente como un método terapéutico para pacientes con lesión esplénica o enfermedades hematológicas benignas³. Sin embargo, los pacientes con esplenectomía enfrentan una serie de complicaciones a largo plazo. Las infecciones bacterianas son las complicaciones mejor reconocidas de la esplenectomía^4,5. Recientemente, la abrumadora sepsis post-esplenectomía ha sido reconocida como una complicación intensiva de la esplenectomía asociada a una alta mortalidad⁶. Por otra parte, estudios epidemiológicos recientes indican que la esplenectomía puede estar asociada a la ocurrencia de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que aún quedan por explorar las funciones fisiológicas del bazo^7,8.

En la clínica se han utilizado tanto autotrasplante de bazo como alotrasplante de bazo. Actualmente, el autotrasplante de bazo mediante la implantación de secciones de tejido esplámico en bolsas creadas en el epiplón mayor se considera como la única posibilidad para preservar la función esplénica después de la esplenectomía traumática^9,10. Sin embargo, la eficacia de esta cirugía es discutible como complicaciones post-cirugía como necrosis aséptica del tejido esplémico y la obstrucción del intestino delgado debido a adherencias postoperatorias podrían ocurrir¹¹. La alotrasplante de bazo está implicada en el trasplante multivisceral¹². La evidencia clínica del trasplante multivisceral sugiere que el alotrasplante de bazo puede desempeñar un papel protector en el rechazo de los aloinjertos intestinales pequeños sin causar enfermedad de injerto contra huésped (EICH)¹². Sin embargo, la literatura sobre el efecto beneficioso del alotrasplante de bazo como componente del trasplante multivisceral sigue siendo limitada y los mecanismos subyacentes permanecen por definir. En 2006, Yair Reisner y otros informaron que el trasplante de tejido de bazo embrionario de cerdo que no tiene células T a los ratones podría curar la hemofilia a, una enfermedad genética sin causar la EICH¹³, apoyando que el transplante de bazo tiene una promesa terapéutica en ciertas enfermedades. Por lo tanto, es necesario seguir investigando sobre el potencial terapéutico del trasplante de bazo.

Los modelos animales de trasplante de bazo son valiosos para explorar la función no apreciada de las células inmunes derivadas del bazo en la progresión de la enfermedad, así como para probar el posible efecto terapéutico del trasplante de bazo. Se han documentado modelos experimentales de trasplantes de bazo enteros desde principios de 1900, según lo revisado por Cohen¹⁴. En 1969, Coburn Richard J. y Lee et al. detalló la técnica del trasplante de bazo en ratas^15,16. Más recientemente, SWIRSKI FK y otros describieron un modelo de ratón de trasplante de bazo¹⁷. En comparación con los modelos de ratas, los modelos de ratones de trasplante de bazo son más atractivos debido a sus diversas ventajas inherentes. Por ejemplo, al utilizar un modelo de ratón, podemos acceder a una amplia variedad de reactivos no disponibles para los modelos de ratas. Por otra parte, mediante el uso de ratones Congénicos (por ejemplo, ratones con CD 45.1/CD 45.2 fondo), un trasplante singénico de bazo hace posible rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos¹⁸. Basado en el trabajo de SWIRSKI FK et al.¹⁷, también establecimos este protocolo simplificado y mejorado de trasplante de bazo en ratones. El protocolo descrito a continuación combina la confiabilidad y la viabilidad de una manera estandarizada y se puede utilizar como una herramienta para estudiar la biología del bazo y la inmunidad al trasplante.

Protocol

Todos los procedimientos y el uso de animales en este estudio se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité interno de cuidado y uso de animales de la Universidad del noroeste (IACUC). En este estudio, de 8 a 10 semanas de edad, CD 45.2 y CD 45.1 ratones (tanto en el fondo BALB/c, del laboratorio Jackson) se utilizaron como donantes de bazo y receptores, respectivamente, para crear modelos de trasplante de bazo singénico. Todos los animales fueron alojados en el ambiente estéril en las instalacio…

Representative Results

Todo el procedimiento de trasplante de bazo de ratón se puede completar dentro de 90 min por microcirujanos experimentados. Nuestro laboratorio ha realizado más de 100 trasplantes de bazo en ratones. La tasa de éxito es más de 90%, como se define por la supervivencia del ratón receptor y el injerto de bazo para el día postoperatorio (POD) 1 o POD 7 (nuestro punto final del estudio). La supervivencia del injerto del bazo fue confirmada por la apariencia macroscópica y el análisis d…

Discussion

Una evidencia convincente sugiere que los monocitos derivados del bazo desempeñan un papel importante en los procesos inflamatorios estériles como la aterosclerosis¹⁹, el cerebro isquémico agudo²⁰ o la lesión pulmonar¹⁸, así como la lesión I/R miocárdica y Remodelación^21,22,23. Estos informes destacan el papel de subreconocimiento del bazo en muchas …

Materials

Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955