Utilisation de la microscopie de force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques et la pression turgor des cellules et des tissus végétaux
Summary
Ici, nous présentons la microscopie de force atomique (AFM), actionnée comme outil de nano- et de micro-indentation sur des cellules et des tissus. L’instrument permet l’acquisition simultanée de la topographie de surface 3D de l’échantillon et de ses propriétés mécaniques, y compris le modulus de la paroi cellulaire de Young ainsi que la pression de la turgor.
Abstract
Nous présentons ici l’utilisation de la microscopie de force atomique pour indenter les tissus végétaux et récupérer ses propriétés mécaniques. À l’aide de deux microscopes différents en mode d’indentation, nous montrons comment mesurer un modulus élastique et l’utilisons pour évaluer les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire. En outre, nous expliquons également comment évaluer la pression de turgor. Les principaux avantages de la microscopie par force atomique sont qu’elle est non invasive, relativement rapide (5 à 20 min), et que pratiquement n’importe quel type de tissu végétal vivant qui est superficiellement plat peut être analysé sans avoir besoin de traitement. La résolution peut être très bonne, en fonction de la taille de la pointe et du nombre de mesures par zone unitaire. Une limitation de cette méthode est qu’elle ne donne qu’un accès direct à la couche cellulaire superficielle.
Introduction
La microscopie par force atomique (AFM) appartient à la famille de la microscopie de la sonde de balayage (SPM), où une pointe avec un rayon de quelques nanomètres scanne habituellement la surface d’un échantillon. La détection d’une surface n’est pas réalisée par des méthodes optiques ou à base d’électrons, mais par les forces d’interaction entre la pointe et la surface de l’échantillon. Ainsi, cette technique ne se limite pas à la caractérisation topographique d’une surface d’échantillon (résolution 3D qui peut descendre à quelques nanomètres), mais permet également la mesure de tout type de forces d’interaction telles que l’électrostatique, van der Waals ou les forces de contact. En outre, la pointe peut être utilisée pour appliquer des forces à la surface d’un échantillon biologique et mesurer la déformation résultante, la soi-disant «indentation», afin de déterminer ses propriétés mécaniques (par exemple, le modulus de Young, les propriétés viscoélastiques).
Les propriétés mécaniques des parois cellulaires végétales sont essentielles pour être prises en compte lors de l’essai de comprendre les mécanismes sous-jacents aux processus de développement1,2,3. En effet, ces propriétés sont étroitement contrôlées au cours du développement, en particulier depuis l’adoucissement de la paroi cellulaire est nécessaire pour permettre aux cellules de se développer. L’AFM peut être utilisé pour mesurer ces propriétés et étudier la façon dont elles changent entre les organes, les tissus ou les stades de développement.
Dans cet article, nous décrivons comment nous utilisons l’AFM pour mesurer à la fois les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire et la pression de la turgor. Ces deux applications sont démontrées sur deux microscopes Différents De l’AFM et sont détaillées ici après.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’émergence des formes dans les plantes est principalement déterminée par le taux coordonné et la direction de la croissance pendant le temps et l’espace. Les cellules végétales sont enfermées dans une paroi cellulaire rigide faite d’une matrice polysaccharidique, qui les colle ensemble. En conséquence, l’expansion cellulaire est contrôlée par l’équilibre entre la pression de turgor tirant sur la paroi cellulaire, et la rigidité de la paroi cellulaire résistant à cette pression. Afin de comprendre les méca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier l’équipe de PLATIM pour son soutien technique, ainsi qu’Arezki Boudaoud et les membres de l’équipe Biophysic du laboratoire RDP pour des discussions utiles.
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
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