原子間力顕微鏡を用いて植物細胞と植物組織の機械的特性とターゴール圧を測定
Summary
ここでは、細胞や組織に対してナノ・マイクロインデントツールとして動作する原子力顕微鏡(AFM)を紹介する。器械はサンプルの3D表面の地形および細胞壁ヤングの係数およびターゴール圧力を含む機械特性の同時獲得を可能にする。
Abstract
ここでは、原子組織をインデントし、その機械的特性を回復するための原子間力顕微鏡の使用を提示します。インデントモードで2つの異なる顕微鏡を使用して、弾性率を測定し、それを使用して細胞壁の機械的特性を評価する方法を示します。また、ターゴル圧力の評価方法についても説明する。原子間力顕微鏡検査の主な利点は、非侵襲的で比較的迅速な(5〜20分)であり、表面的に平坦な生きている植物組織の事実上あらゆるタイプが治療を必要とせずに分析できることである。解像度は、先端のサイズと単位面積あたりの測定値の数に応じて、非常に良好なことができます。この方法の 1 つの制限は、表面的なセル層への直接アクセスのみを与える場合です。
Introduction
原子力顕微鏡(AFM)は、スキャンプローブ顕微鏡(SPM)ファミリーに属し、通常数ナノメートルの半径を持つ先端がサンプルの表面をスキャンします。表面の検出は、光学式または電子ベースの方法ではなく、先端とサンプル表面との相互作用力によって達成される。したがって、この技術は、サンプル表面の地形特性解析(数ナノメートルまで下がることができる3D解像度)に限定されるだけでなく、静電、ファンデルワールス、接触力などのあらゆるタイプの相互作用力の測定も可能です。さらに、先端は、生体試料の表面に力を加え、得られた変形、いわゆる「インデント」を測定し、その機械的特性(例えば、ヤングの係数、粘弾性特性)を決定するために使用することができる。
植物細胞壁の機械的特性は、発達過程1、2、3の基礎となるメカニズムを理解しようとする際に考慮することが不可欠である。実際、これらの特性は、細胞が成長することを可能にするために細胞壁軟化が必要とされるので、特に、発達中に厳密に制御される。AFMは、これらの特性を測定し、臓器、組織または発達段階の間で変化する方法を研究するために使用することができます。
本論文では,AFMを用いて細胞壁の機械的特性とターゴール圧の両方を測定する方法について述べた.これらの2つの適用は2つの異なったAFM顕微鏡で実証され、後でここで詳しく説明される。
Protocol
1.細胞壁の機械的特性の測定 注:アラビドプシスの現像婦人科の例が提示される。 生体試料の調製 アラビドプシス4の公表段階決定に従って、ステージ9〜10(長さ約0.5mm)で閉じた花芽を収集します。双眼鏡の下で、細かいピンセットを使用して、慎重に開発の段階を確認し、花の中心に位置する婦人科を収集?…
Representative Results
図1Aと図1Bは、QIマップを取得する目的の領域を見つけるために使用されるプロトコルのステップ1.3.4~1.3.6の結果を示すスクリーンショットを示しています。目的の領域が傾斜面にないために選択された(すなわち、可能な限り平坦である)ことは言及する価値があります。実際には、Routier et al.5によって気づ…
Discussion
植物の形状の出現は、主に時間と空間の間の成長の協調速度と方向によって決定されます。植物細胞は、それらを一緒に接着するポリサカリディックマトリックスで作られた硬質細胞壁に包まれています。その結果、細胞増殖は、細胞壁を引っ張るターゴール圧と、この圧力に抵抗する細胞壁の剛性との平衡によって制御される。発達の根底にあるメカニズムを理解するためには、特定の器?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PLATIMチームのテクニカルサポートに感謝するとともに、RDPラボのアレスキ・ブーダウドと生物物理学チームのメンバーに役立つディスカッションを行ってくださったことに感謝します。
Materials
| Growth medium | |||
| 1000x vimatin stock solution | used to make ACM, composition see Stanislas et al., 2017. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | ||
| 1-N-Naphthylphthalamic acid (NPA) | Sigma-Aldrich/Merck | 132-66-1 | add to Arabidopsis medium, 10 μM. Add after autoclaving, before pouring. |
| agar-agar | Sigma-Aldrich/Merck | 9002-18-0 | add to Arabidopsis medium, 1% w/v. |
| agarose | Merck Millipore | 9012-36-6 | used to make solid ACM, 0.8% w/v. |
| Arabidopsis medium | Duchefa Biochimie | DU0742.0025 | For in vitro arabidopsis culture, 11.82g/L. |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Sigma-Aldrich/Merck | 13477-34-4 | add to Arabidopsis medium, 2mM. |
| MURASHIGE & SKOOG MEDIUM | Duchefa Biochimie | M0221.0025 | Basal salt mixture, used to make ACM, 2.2g/L. |
| N6-benzyladenine (BAP) | Sigma-Aldrich/Merck | 1214-39-7 | used to make ACM, 555 nM. Add to ACM after autoclaving, before pouring. |
| oryzalin | Sigma-Aldrich/Merck | 19044-88-3 | for oryzalin treatement, 10 μg/mL. |
| plant preservation mixture (PPM) | Plant Cell Technology | used to make ACM, 0.1% v/v. Add to ACM after autoclaving, before pouring. | |
| Potassium hydroxide | Duchefa Biochimie | 1310-58-3 | used to make Arabidopsis medium and ACM, both pH 5.8. |
| sucrose | Duchefa Biochimie | 57-50-1 | used to make ACM, 1% w/v. |
| Tools for AFM | |||
| BioScope Catalyst BioAFM | Bruker | The AFM used for turgor pressure measurement in this protocol. | |
| Nanowizard III + CellHesion | JPK (Bruker) | The AFM used for measuring mechanical properties. | |
| Patafix | UHU | D1620 | |
| Reference elasitic structure | NanoIdea | 2Z00026 | |
| Reprorubber-Thin Pour | Flexbar | 16135 | biocompatible glue. |
| Spherical AFM tips | Nanoandmore | SD-SPHERE-NCH-S-10 | Tips used for measuring mechanical properties. |
References
- Du, F., Guan, C., Jiao, Y. Molecular mechanisms of leaf morphogenesis. Molecular Plant. 11, 1117-1134 (2018).
- Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 850-861 (2005).
- Dumais, J. Can mechanics control pattern formation in plants?. Current Opinion in Plant Biology. 10, 58-62 (2007).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. The Plant Cell. 2, 755-767 (1990).
- Routier-Kierzkowska, A. L., et al. Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics. Plant Physiology. 158 (4), 1514-1522 (2012).
- Corson, F., et al. Turning a plant tissue into a living cell froth through isotropic growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 8453-8458 (2009).
- Hervieux, N., et al. A mechanical feedback restricts sepal growth and shape in Arabidopsis. Current Biology. 26, 1019-1028 (2016).
- Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J., Lecuit, T. Chapter 11 – In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell. 139, 203-223 (2017).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. P. Non-Hertzian Approach to Analyzing Mechanical Properties of Endothelial Cells Probed by Atomic Force Microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128 (2), 176-184 (2006).
- Beauzamy, L., Louveaux, M., Hamant, O., Boudaoud, A. Mechanically, the shoot apical meristem of Arabidopsis behaves like a shell inflated by a pressure of about 1MPa. Frontiers in Plant science. 6 (1038), 1-10 (2015).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176, 1547-1558 (2018).
- Farahi, R. H., et al. Plasticity, elasticity, and adhesion energy of plant cell walls: nanometrology of lignin loss using atomic force microscopy. Scientific Reports. 7, 152 (2017).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21, 1720-1726 (2011).
- Cosgrove, D. J. Diffuse growth of plant cell walls. Plant Physiology. 176, 16-27 (2018).
- Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 66 (7), 3789-3798 (1995).
- Sader, J. E., Chon, J. W. M., Mulvaney, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments. 70 (10), 3967-3969 (1999).
- Sikora, A. Quantitative Normal Force Measurements by Means of Atomic Force Microscopy Towards the Accurate and Easy Spring Constant Determination. Nanoscience and Nanometrology. 2 (1), 8-29 (2016).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
Cite This Article
Bovio, S., Long, Y., Monéger, F. Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues. J. Vis. Exp. (149), e59674, doi:10.3791/59674 (2019).