소독멜라노가스터에서 새로운 신경보호 유전자를 식별하기 위한 생체 전방 유전자 스크린
Summary
우리는 Drosophila melanogaster에있는 신경 변성을 전시하는 돌연변이를 위한 스크린에 전방 유전 접근을 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 그것은 궁극적으로 신경 보호의 프로세스와 관련있는 새로운 유전자를 확인하기 위하여 등반 분석, 기관학 분석, 유전자 매핑 및 DNA 순서를 통합합니다.
Abstract
신경 퇴행성 질환의 발병과 진행에 대해 이해해야 할 것이 많이 있습니다. 화학 돌연변이원을 이용한 전방 유전자 스크리닝은 인간과 보존된 세포 경로를 공유하는 Drosophila 및 그밖 모형 유기체 중 유전자에 돌연변이 표현형을 매핑하기 위한 유용한 전략입니다. 관심의 돌연변이 유전자가 파리의 초기 발달 단계에서 치명적이지 않은 경우, 등반 분석은 낮은 등반 속도와 같은 감소 뇌 기능의 현상형 지표를 위해 스크리닝을 실시 할 수있다. 이어서, 뇌 조직의 이차 조직학적 분석은 신경변성 표현형을 채점함으로써 유전자의 신경보호 기능을 검증하기 위해 수행될 수 있다. 유전자 매핑 전략은 이러한 동일한 분석에 의존하는 meiotic 및 결핍 매핑을 포함하며, 관심 있는 유전자에서 가능한 뉴클레오티드 변화를 식별하기 위해 DNA 염기서열 분석이 뒤따를 수 있다.
Introduction
뉴런은 대부분 유사분열 후이며1,2를나눌 수 없습니다. 대부분의 동물에서, 신경 보호 메커니즘 유기 체의 수명 내내 이러한 세포를 유지 하기 위해 존재, 특히 노년 기에 뉴런은 손상에 가장 취약. 이러한 메커니즘의 근간이 되는 유전자는 전방 유전 프로토콜을 사용하여 신경 변성을 나타내는 돌연변이체에서 확인할 수 있습니다. 에틸 메탄설포네이트(EMS) 또는 N-에틸-N-니드로소레아(ENU)와 같은 화학적 돌연변이원을 이용한 전방 유전적 스크린은 유도하는 무작위 점 돌연변이로 인해 특히 유용하며, 이로 인해 본질적으로 편견없는 접근법이 빛을 발하고 있습니다. 진핵 모델 유기체3,4,5의 수많은 유전자 기능 (대조적으로, X선 돌연변이발생은 DNA 나누기를 생성하고 포인트 돌연변이가 아닌 재배열을 초래할 수 있다 6).
일반적인 과일 파리 Drosophila melanogaster는 그것의 높은 품질, 잘 달린 게놈 순서, 고도로 발달된 유전 공구를 가진 모형 유기체로 그것의 긴 역사 때문에 이 스크린을 위한 이상적인 주제이고, 가장 중요한 것은, 그것의 공유 인간과 진화역사7,8. 이 프로토콜의 적용가능성에 있는 제한 요인은 9세에 시험을 방지할 돌연변이된 유전자에 기인한초기 치사입니다. 그러나, 비 치명적인 돌연변이의 경우, 부정적인 지질 학적 을 활용하는 등반 분석법은 10 기능하는 손상된 모터를정량화하는 광범위한 방법이지만 간단합니다. 충분한 운동 반응성을 나타내기 위해 파리는 방향을 결정하고 위치를 감지하며 움직임을 조정하기 위해 신경 기능에 의존합니다. 파리가 자극에 반응하여 충분히 올라갈 수 없다는 것은 따라서 신경학적 결함11을나타낼 수 있다. 특정 결함이 있는 등반 표현형이 확인되면, 뇌 조직의 조직학적 분석과 같은 보조 스크린을 이용한 추가 테스트는 등반 결함이 있는 파리의 신경 변성을 식별하는 데 사용될 수 있습니다. 후속 유전자 매핑은 관심 있는 결함있는 신경 보호 유전자를 운반하는 염색체상에 게놈 영역을 밝히기 위하여 그 때 이용될 수 있습니다. 관심 있는 염색체 영역을 좁히기 위해, 염색체상에 공지된 위치를 가진 지배적인 마커 유전자를 운반하는 돌연변이 플라이 라인을 이용한 meiotic 매핑이 수행될 수 있다. 마커 유전자는 2개의 좌위 사이 재결합의 주파수가 유전자의 대략적인 위치를 지도로 하기 위하여 이용될 수 있는 측정 가능한 거리를 제공하기 때문에 돌연변이를 위한 기준점역할을 한다. 마지막으로, 관심 있는 중증 염색체 영역에 균형 잡힌 결핍을 운반하는 선으로 돌연변이 선을 교차하는 것은 그것의 알려진 표현형이 표현되는 경우에 관심있는유전자가 확인될 수 있는 보완 시험을 만듭니다 5. 확인된 유전자에서 다형성 뉴클레오티드 서열은, 아마도 변경된 아미노산 서열의 결과로, 유전자를 시퀀싱하고 이를 Drosophila 게놈 서열과 비교하여 평가될 수 있다. 관심 있는 유전자의 후속 특성화는 추가 돌연변이 대문자의 검사, 돌연변이 구조 실험 및 추가 표현형의 검사를 포함할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila에 있는 전방 유전 스크린은 나이 의존적인 신경 보호를 포함하여 다른생물학 프로세스에서 관련시킨 유전자를 확인하는 효과적인 접근이었습니다 5,23,24, 25. 이 전략을 사용하여, 우리는 새로운 신경 보호 유전자17로 brat를 확인하는 데 성공했습니다.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 특히 배리 가네츠키 박사에게 감사드리며, 실험실에서 유전 스크린이 수행되어 신경 보호 유전자로서 brat의 식별 및 특성을 허용합니다. 우리는 친절이 문서에 제시된 유전 스크린에 사용된 ENU 돌연변이 파리의 컬렉션을 제공하는 스티븐 로비도우 박사에게 감사드립니다. 우리는 이 프로젝트의 기간 동안 도움이 토론에 대한 Ganetzky 연구소의 구성원, 박사 그레이스 보호프 – 포크와 데이비드 Wassarman, 링 링 호와 밥 크레버 기술 지원에 대한, 박사 아키 이케다에서 자신의 마이크로 토메 시설의 사용에 대한 감사 위스콘신 대학교와 킴 래키 박사, 앨라배마 대학교 광학 분석 시설.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
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