En Vivo Forward Genetic Screen para Identificar Nuevos Genes Neuroprotectores en Drosophila melanogaster
Summary
Presentamos un protocolo utilizando un enfoque genético directo para la detección de mutantes que exhiben neurodegeneración en Drosophila melanogaster. Incorpora un ensayo de escalada, análisis histológico, mapeo genético y secuenciación de ADN para identificar en última instancia nuevos genes relacionados con el proceso de neuroprotección.
Abstract
Hay mucho que entender sobre la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo los genes subyacentes responsables. El cribado genético hacia adelante utilizando mutágenos químicos es una estrategia útil para mapear fenotipos mutantes a genes entre Drosophila y otros organismos modelo que comparten vías celulares conservadas con los seres humanos. Si el gen mutado de interés no es letal en las primeras etapas de desarrollo de las moscas, se puede llevar a cabo un ensayo de escalada para detectar indicadores fenotípicos de disminución del funcionamiento cerebral, como bajas tasas de escalada. Posteriormente, el análisis histológico secundario del tejido cerebral se puede realizar con el fin de verificar la función neuroprotectora del gen mediante la puntuación de fenotipos de neurodegeneración. Las estrategias de mapeo genético incluyen mapeo meiótico y deficiencia que se basan en estos mismos ensayos pueden ser seguidos por la secuenciación del ADN para identificar posibles cambios de nucleótidos en el gen de interés.
Introduction
Las neuronas son en su mayor parte post-mitotica sin dividir1,2. En la mayoría de los animales, existen mecanismos neuroprotectores para mantener estas células a lo largo de la vida útil del organismo, especialmente a la edad anterior cuando las neuronas son más vulnerables al daño. Los genes subyacentes a estos mecanismos se pueden identificar en mutantes que presentan neurodegeneración, un indicador fenotípico para la pérdida de neuroprotección, utilizando un protocolo genético directo. Las pantallas genéticas delanteras que utilizan mutágenos químicos como el metanoesulfonato etílico (EMS) o N-etil-N-nitrosourea (ENU) son particularmente útiles debido a las mutaciones de puntos aleatorios que inducen, lo que resulta en un enfoque inherentemente imparcial que ha arrojado luz sobre numerosas funciones genéticas en los organismos modelo eucariotas3,4,5 (en contraste, la mutagénesis de rayos X crea roturas de ADN y puede dar lugar a reorganización en lugar de mutaciones puntuales6).
La mosca fruta común Drosophila melanogaster es un tema ideal para estas pantallas debido a su alta calidad, secuencia de genoma bien anotada, su larga historia como organismo modelo con herramientas genéticas altamente desarrolladas, y lo más significativo, su compartido historia evolutiva con los seres humanos7,8. Un factor limitante en la aplicabilidad de este protocolo es la letalidad temprana causada por los genes mutados, lo que impediría las pruebas a la edad de9años. Sin embargo, para las mutaciones no letales, un ensayo de escalada, que aprovecha la geotaxis negativa, es un método simple, aunque extenso, para cuantificar el funcionamiento motor deteriorado10. Para exhibir suficiente reactividad locomotora, las moscas dependen de las funciones neuronales para determinar la dirección, detectar su posición y coordinar el movimiento. Por lo tanto, la incapacidad de las moscas para subir lo suficiente en respuesta a los estímulos puede indicar defectos neurológicos11. Una vez que se identifica un fenotipo de escalada defectuoso en particular, se pueden utilizar más pruebas utilizando una pantalla secundaria como el análisis histológico del tejido cerebral para identificar la neurodegeneración en moscas que escalan. La cartografía genética posterior se puede utilizar para revelar la región genómica en el cromosoma que lleva el gen neuroprotector defectuoso de interés. Para reducir la región cromosómica de interés, se puede realizar un mapeo meiotico utilizando líneas volantes mutantes que transportan genes marcadores dominantes con ubicaciones conocidas en el cromosoma. Los genes marcadores sirven como punto de referencia para la mutación, ya que la frecuencia de recombinación entre dos loci proporciona una distancia medible que se puede utilizar para mapear la ubicación aproximada de un gen. Por último, el cruce de las líneas mutantes con líneas que llevan deficiencias equilibradas en la región cromosómica meiotamente mapeada de interés crea una prueba de complementación en la que se puede verificar el gen de interés si se expresa su fenotipo conocido5. Las secuencias de nucleótidos polimórficos en el gen identificado, lo que puede resultar en secuencias de aminoácidos alteradas, se pueden evaluar secuenciando el gen y comparándolo con la secuencia del genoma de Drosophila. La caracterización posterior del gen de interés puede incluir pruebas de alelos mutantes adicionales, experimentos de rescate de mutaciones y examen de fenotipos adicionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las pantallas genéticas delanteras en Drosophila han sido un enfoque eficaz para identificar genes implicados en diferentes procesos biológicos, incluyendo la neuroprotección dependiente de la edad5,23,24, 25. Usando esta estrategia, logramos identificar al mocoso como un gen neuroprotector novedoso17.
Un paso crítico en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos particularmente agradecidos al Dr. Barry Ganetzky, en quién es el laboratorio de la pantalla genética que se realizó, permitiendo la identificación y caracterización del mocoso como un gen neuroprotector. Agradecemos al Dr. Steven Robinow por proporcionar amablemente la colección de moscas mutadas en uEN utilizadas en la pantalla genética presentada en este artículo. Agradecemos a los miembros del laboratorio Ganetzky, los doctores Grace Boekhoff-Falk y David Wassarman por sus útiles debates a lo largo de la duración de este proyecto, Ling Ling Ho y Bob Kreber por asistencia técnica, el Dr. Aki Ikeda para el uso de su instalación de microtome en el Universidad de Wisconsin y el Dr. Kim Lackey y el Centro de Análisis Óptico de la Universidad de Alabama.
Materials
| Major equipment | |||
| Fume hood for histology | |||
| Light Microscope | Nikon | Eclipe E100 | Preferred objective for imaging is X20 |
| Imaging software | Nikon | ||
| Microscope Camera | Nikon | ||
| Thermal cycler | Eppendorf | ||
| Fly pushing and climbing assay | |||
| VWR® Drosophila Vial, Narrow | VWR | 75813-160 | |
| VWR® General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-912 | |
| Standard mouse pad | |||
| Stereoscope | Motic | Model SMZ-168 | |
| CO2 anesthesia station (Blowgun, foot valve, Ultimate Flypad) | Genesee Scientific | 54-104, 59-121, 59-172 | Doesn’t iinclude CO2 tank |
| Fine-Tip Brushes | SOLO HORTON BRUSHES, INC. | ||
| Drosophila Incubator | VWR | 89510-750 | |
| Gene mapping | |||
| CantonS | Bloomington Drosophila Stock Center | 9517 | |
| w1118 | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | |
| yw | Bloomington Drosophila Stock Center | 6599 | |
| Drosophila line used for recombination mapping | Bloomington Drosophila Stock Center | 3227 | Genotype: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3 |
| CyO/sno[Sco] | Bloomington Drosophila Stock Center | 2555 | Drosophila balancer line used for recombination mapping |
| Deficiency Kit for chromosome 2L | Bloomington Drosophila Stock Center | DK2L | Cook et al., 2012 |
| Histology analysis | |||
| Ethanol, (100%) | Thermo Fischer Scientific | A4094 | |
| Chloroform | Thermo Fischer Scientific | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fischer Scientific | A38-500 | |
| Fisherbrand™ Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Thermo Fischer Scientific | 05-408-129 | |
| Histochoice clearing agent 1X | VWR Life Sciences | 97060-934 | |
| Harris Hematoxylin | VWR | 95057-858 | |
| Eosin | VWR | 95057-848 | |
| Thermo Scientific™ Richard-Allan Scientific™ Mounting Medium | Thermo Scientific™ 4112 | 22-110-610 | CyO/sna[Sco] |
| Unifrost Poly-L-Lysine microscope slides, 75x25x1mm, EverMark Select Plus | Azer Scientific | ||
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545M | Dimensions: 24×60 mm |
| Traceable timer | VWR | ||
| Slide Warmer | Barnstead International | model no. 26025 | |
| Slide tray and racks | DWK Life Sciences | Rack to hold 20 slides | |
| Fisherbrand™ General-Purpose Extra-Long Forceps | Fisherbrand | 10-316A | |
| Kimwipes™ | Kimberly-Clark™ Professional | ||
| 6 inch Puritan applicators | Hardwood Products Company, Guilford, Maine | 807-12 | |
| VWR® Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Tupperware or glass containers for histology liquids | 16 + 1 for running water | ||
| High Profile Coated Microtome Blades | VWR | 95057-834 | |
| Corning™ Round Ice Bucket with Lid, 4L | Corning™ | ||
| Beaker | Or other container for ice water and cassettes | ||
| Tissue Bath | Precision Scientific Company | 66630 | |
| Microtome | Leica Biosystems | ||
| Molecular analysis | |||
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| Ex Taq DNA polymerase | TaKaRa | 5 U/μl | |
| Invitrogen™ SYBR™ Safe™ DNA Gel Stain | Invitrogen™ | ||
| UltraPure™ Agarose | Invitrogen™ | ||
| 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen™ | ||
| ApE-A plasmid Editor software | Available for free download | ||
| Statistical analysis | |||
| R software package | |||
| Further analysis | |||
| y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1] | Bloomington Drosophila Stock Center | 59967 | |
References
- Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances. Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).
- Aranda-Anzaldo, A. The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure. Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).
- Haelterman, N. A., et al. Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster. Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).
- Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice. The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila. Cell. 131 (1), 136-145 (2007).
- Helfrich, C., Engelmann, W. Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes. Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).
- R Development Core Team. . R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Bokel, C. EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping. Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).
- Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila Melanogaster. , (1992).
- Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), R21 (2012).
- Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila. Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).
- Gloor, G. B., et al. Type I repressors of P element mobility. 遗传学. 135 (1), 81-95 (1993).
- Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity. Development. 141 (1), 51-62 (2014).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Loewen, C. A., Ganetzky, B. Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome. 遗传学. 208 (4), 1535-1552 (2018).
- Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).
- Lessing, D., Bonini, N. M. Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants. Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).
- Peng, F., et al. Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer’s disease-like symptoms in Drosophila. Scientific Reports. 5, 16816 (2015).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
- Gonzalez, M. A., et al. Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens. Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).
- Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila. 遗传学. 161 (3), 1197-1208 (2002).
