Summary

Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

Published: October 08, 2019
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Summary

Les expériences de microréseau de liaison protéique (PBM) combinées à des essais biochimiques relient les propriétés de liaison et catalytiques de la primase de l’ADN, une enzyme qui synthétise les amorces d’ARN sur l’ADN modèle. Cette méthode, désignée comme profilage primase à haut débit (HTPP), peut être utilisée pour révéler les modèles de liaison de l’ADN d’une variété d’enzymes.

Abstract

La primase d’ADN synthétise les amorces courtes d’ARN qui initient la synthèse d’ADN des fragments d’Okazaki sur le brin lanel par la polymérase d’ADN pendant la réplication d’ADN. La liaison des primases procaryotes de DnaG-comme à l’ADN se produit à une séquence spécifique de reconnaissance de trinucleotide. C’est une étape charnière dans la formation des fragments d’Okazaki. Les outils biochimiques conventionnels qui sont utilisés pour déterminer la séquence de reconnaissance de l’ADN de la primase de l’ADN ne fournissent que des informations limitées. À l’aide d’un test de liaison à haut débit à base de microarray et d’analyses biochimiques consécutives, il a été démontré que 1) le contexte de liaison spécifique (séquences de liaison du site de reconnaissance) influence la force de liaison de la primase de l’ADN à son modèle L’ADN, et 2) la liaison plus forte de primase à l’ADN donne des amorces plus longues d’ARN, indiquant une plus grande processivité de l’enzyme. Cette méthode combine PBM et primase activity test et est désigné comme profilage primase à haut débit (HTPP), et il permet la caractérisation de la reconnaissance de séquence spécifique par primase de l’ADN dans un temps et une évolutivité sans précédent.

Introduction

Le HTPP utilise la technologie de microréseau de liaison de l’ADN combinée à l’analyse biochimique (Figure 1) pour identifier statistiquement les caractéristiques spécifiques des modèles d’ADN qui affectent l’activité enzymatique de la primase de l’ADN. Par conséquent, HTPP fournit une plate-forme technologique qui facilite un saut de connaissances dans le domaine. Les outils classiques utilisés pour déterminer les sites de reconnaissance primase n’ont pas la capacité de produire une quantité massive de données, alors que le PTDH le fait.

LE PBM est une technique couramment utilisée pour déterminer les préférences de liaison des facteurs de transcription à l’ADN1,2; cependant, il n’est pas approprié pour la détection de la liaison faible/transitoire des protéines à l’ADN. Contrairement au PBM universel qui fournit des informations sur la spécificité moyenne de liaison des protéines à toutes les séquences possibles composées de huit paires de base, HTPP est basé sur la bibliothèque de modèles d’ADN à brin unique comprenant des éléments de séquence uniques. Ces éléments de séquence d’ADN impliquent des dizaines de milliers de séquences génomiques courtes (quelques dizaines de bp), ainsi que des séquences d’ADN conçues par calcul enrichies dans certains éléments de séquence répétitive d’ADN présents dans le génome, qui possèdent un contenu moyen différent de GC . Une telle approche à haut débit permet de déterminer, de manière systématique, quantitative et hypothétique, les propriétés liées à la séquence qui sont importantes pour la liaison primase et son activité enzymatique3. En particulier, le lien important entre les préférences de liaison primase-ADN (modulées par des séquences d’ADN flanquant des sites de liaison trinucléotides spécifiques) et la processivité primase a été identifiée pour ce système enzymatique4.

La nouvelle technologie a été appliquée pour revoir notre compréhension des sites de reconnaissance primase, même pour la primase de l’ADN T7 qui a fait l’objet d’études approfondies5. Plus précisément, le réexamen de concepts classiques, tels que les sites de reconnaissance de l’ADN de primase de l’ADN T7 (qui ont été déterminés il y a près de quatre décennies 6) à l’aide d’un microréseau liant protéine-ADN (PBM) a permis d’obtenir un aperçu sans précédent des caractéristiques liées aux la séquence de flanc de ces sites de reconnaissance3. On s’attendait à ce que les séquences flanquant le site de reconnaissance trinucléotide de la primase d’ADN T7 (5′-GTC-3′) soient aléatoires. Au lieu de cela, nous avons constaté que les séquences de flanc TG-riches augmentent les chances de primase d’ADN de T7 pour synthétiser des amorces plus longues d’ARN indiquant une augmentation de processivity.

D’autres méthodes qui peuvent être utilisées pour étudier les propriétés de liaison de l’ADN des protéines in vitro comprennent l’analyse de changement de mobilité électrophorétique (EMSA)7, DNase I empreinte8, résonance de surface-plasmon (SPR)9, et le sud-ouest ballonnement 10. Il s’agit toutefois de méthodes à faible débit qui ne s’appliquent qu’à l’étude d’un petit nombre de séquences d’ADN. De plus, la précision et la sensibilité de certaines de ces techniques (p. ex., EMSA) sont faibles. D’autre part, la sélection in vitro11 est une technique qui, tout comme PBM, peut être utilisée pour l’identification de nombreuses séquences de liaison. Cependant, les séquences de faible affinité sont généralement exclues dans la plupart des applications de la sélection in vitro; par conséquent, cette approche n’est pas adaptée pour obtenir des données comparatives de liaison pour toutes les séquences disponibles. Le PBM1,2 universel est principalement utilisé pour caractériser les spécificités de liaison des facteurs de transcription des procaryotes et des eucaryotes ainsi que des facteurs spécifiques (par exemple, la présence de certains ligands, cofacteurs, etc.) qui peuvent affecter cette interaction12.

HTPP étend l’application PBM aux enzymes de traitement de l’ADN en combinant une puissance statistique à haut débit sans précédent avec une grande précision pour fournir des informations sur le contexte de séquence de liaison. Ces données n’ont pas encore été obtenues pour les primases et les enzymes connexes (qui ont une liaison faible/transitoire à l’ADN) en raison des limitations techniques susmentionnées d’autres techniques disponibles.

Protocol

1. Conception du microarray REMARQUE : Les sondes d’ADN représentent des séquences personnalisées de 36 nucléotides, composées du site de reconnaissance de la primase de l’ADN T7 (GTC) situé entre deux régions à flanc variable, suivie d’une séquence constante de 24 nucléotides attachée à une diapositive de verre3. Nous avons utilisé un format de microarray de 4 x 180 000, qui permettait de repérer chaque séquence d’ADN en six répliques, distribuées au has…

Representative Results

Cette avancée technologique pour cartographier les sites de liaison primase permet d’obtenir des propriétés de liaison d’ADN difficiles, voire impossibles, à observer à l’aide d’outils classiques. Plus important encore, hTPP permet de revisiter la compréhension traditionnelle des sites de liaison primase. Plus précisément, hTPP révèle des spécificités contraignantes en plus des séquences de reconnaissance connues de 5′-GTC-3′, ce qui conduit à des changements dans les activi…

Discussion

La méthode PBM a été largement utilisée pour étudier les propriétés de liaison des facteurs de transcription et peut également être appliquée aux enzymes de traitement de l’ADN, telles que la primase de l’ADN, qui se lient à l’ADN avec une faible affinité. Cependant, certaines modifications des procédures expérimentales sont nécessaires. L’expérience de microarray comporte plusieurs étapes : conception de la bibliothèque d’ADN, préparation de la puce, liaison de la cible protéique, étiquetage fluores…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été soutenue par la FONDATION ISRAEL SCIENCE (subvention no 1023/18).

Materials

40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

References

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
  11. Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
  12. Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).

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Cite This Article
Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

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