Summary

Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

Published: October 08, 2019
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Summary

Experimentos de Microarray de ligação proteica (PBM) combinados com ensaios bioquímicos ligam as propriedades vinculativas e catalíticas da primase do DNA, uma enzima que sintetiza os primers de RNA no DNA do modelo. Este método, designado como o perfilamento do primase da elevado-taxa de transferência (HTPP), pode ser usado para revelar testes padrões DNA-Binding de uma variedade de enzimas.

Abstract

O primase do ADN sintetiza os primers curtos do RNA que iniciam a síntese do ADN de fragmentos de Okazaki na costa retardamento pela polimerase do ADN durante a replicação do ADN. A ligação de procarióticas dnaG-como primases ao ADN ocorre em uma seqüência específica do reconhecimento do trinucleotide. É um passo crucial na formação de fragmentos de Okazaki. As ferramentas bioquímicas convencionais que são usadas para determinar a seqüência do reconhecimento do ADN do primase do ADN fornecem somente a informação limitada. Usando um ensaio de ligação baseado em microarray de alta taxa de transferência e análises bioquímicas consecutivas, foi demonstrado que 1) o contexto de ligação específico (seqüências de flanqueamento do local de reconhecimento) influencia a força de ligação da primase do DNA ao seu modelo DNA, e 2) o emperramento mais forte do primase ao ADN rende uns primers mais longos do RNA, indicando o processivity mais elevado da enzima. Este método combina o ensaio da atividade de PBM e de primase e é designado como o perfilamento do primase da elevado-produção (HTPP), e permite a caracterização do reconhecimento de seqüência específico pelo primase do ADN no tempo e na escalabilidade sem precedentes.

Introduction

O HTPP faz uso da tecnologia de Microarray de ligação ao DNA combinada com a análise bioquímica (Figura 1) para identificar estatisticamente as características específicas dos modelos de DNA que afetam a atividade enzimática da PRIMASE do DNA. Portanto, a HTPP fornece uma plataforma tecnológica que facilita um salto de conhecimento no campo. As ferramentas clássicas usadas para determinar os locais do reconhecimento do primase não têm a habilidade de render a quantidade maciça de dados, visto que HTPP faz.

A PBM é uma técnica rotineiramente utilizada para determinar as preferências vinculativas dos fatores de transcrição ao DNA1,2; Entretanto, não é apropriado para a deteção da ligação fraca/transiente das proteínas ao ADN. Ao contrário do universal PBM que fornece informações sobre a especificidade de ligação de proteínas média para todas as seqüências possíveis consistindo de oito pares de base, HTPP é baseado na biblioteca de modelos de DNA single-encalhado compreendendo elementos de seqüência única. Tais elementos de sequência de DNA envolvem dezenas de milhares de sequências genómicas curtas (poucas dezenas de BP), bem como sequências de DNA computacionalmente projetadas enriquecidas em determinados elementos de seqüência repetitiva de DNA presentes no genoma, que possuem diferentes conteúdos médios de GC . Essa abordagem de alta taxa de transferência permite a determinação de, de forma sistemática, quantitativa e orientada por hipóteses, as propriedades relacionadas à seqüência que são importantes para a vinculação de primase e sua atividade enzimática3. Em particular, a ligação importante entre as preferências de encadernação do primase-DNA, (modulada por sequências de DNA flanqueando sítios de ligação de Tri-nucleotídeo específicos) e a processividade de primase foi identificada para este sistema enzimático4.

A nova tecnologia foi aplicada para rever a nossa compreensão de sítios de reconhecimento de primase, mesmo para a primase de DNA T7 que tem sido extensivamente estudada5. Especificamente, o reexame de conceitos clássicos, tais como sítios de reconhecimento de DNA da primase de DNA T7 (que foram determinados há quase quatro décadas atrás 6) usando microarray de ligação de DNA de proteína (PBM) levou a uma visão sem precedentes sobre as características relacionadas com a seqüência de flanquear esses sites de reconhecimento3. Esperava-se que as sequências flanqueando o local de reconhecimento Tri-nucleotídeo de T7 DNA primase (5 ‘-GTC-3 ‘) será aleatório. Em vez disso, descobrimos que sequências de flanqueamento ricas em TG aumentam as chances de a primase do DNA T7 sintetizar primers de RNA mais longos, indicando um aumento na processividade.

Outros métodos que podem ser usados para estudar Propriedades de ligação de DNA de proteínas in vitro incluem o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforético (EMSA)7, DNase I footprinting8, ressonância de superfície-Plasmon (SPR)9, e blotting do sudoeste 10. These são, entretanto, métodos Low-Throughput somente aplicáveis a investigar um número pequeno de seqüências do ADN. Além disso, a precisão e a sensibilidade de algumas dessas técnicas (por exemplo, EMSA) é baixa. Por outro lado, a seleção in vitro11 é uma técnica que, da mesma forma que a PBM, pode ser utilizada para a identificação de numerosas sequências vinculativas. No entanto, as sequências de baixa afinidade geralmente são excluídas na maioria das aplicações de seleção in vitro; Portanto, essa abordagem não é adequada para a obtenção de dados de vinculação comparativa para todas as seqüências disponíveis. O PBM universal1,2é usado principalmente para caracterizar as especificidades vinculativas dos fatores de transcrição de procariontes e eucariontes, bem como fatores específicos (por exemplo, presença de certos ligantes, cofatores, etc.) que podem afetam essa interação12.

HTPP expande a aplicação de PBM às enzimas de processamento do ADN combinando o poder estatístico sem precedentes da elevado-produção com a elevada precisão para fornecer a informação no contexto obrigatório da seqüência. Tais dados ainda não foram obtidos para primases e enzimas relacionadas (que têm ligação fraca/transitória ao DNA) devido a limitações técnicas acima mencionadas de outras técnicas disponíveis.

Protocol

1. projeto do microarray Nota: as sondas de DNA representam sequências 36-nucleotídicas personalizadas, consistindo no local de reconhecimento para a primase de DNA T7 (GTC) localizada entre duas regiões de flanqueamento variáveis, seguidas por uma sequência de 24 nucleotídeo constante presa a uma lâmina de vidro3. Utilizou-se um formato de Microarray de 4 x 180.000, que permitiu detectar cada sequência de DNA em seis repetições, distribuídas aleatoriamente no …

Representative Results

Este avanço tecnológico para mapear os sítios de encadernação primase permite a obtenção de propriedades de ligação de DNA que são difíceis, se não impossíveis, de observar usando ferramentas clássicas. Mais importante, HTPP permite a revisitação da compreensão tradicional de sítios de encadernação primase. Especificamente, o HTPP revela especificidades vinculativas, além das conhecidas sequências de reconhecimento 5 ‘-GTC-3 ‘, o que leva a alterações nas atividade…

Discussion

O método de PBM tem sido amplamente utilizado para investigar as propriedades vinculativas dos fatores de transcrição e também pode ser aplicado a enzimas de processamento de DNA, como a primase do DNA, que se ligam ao DNA com baixa afinidade. No entanto, certas modificações dos procedimentos experimentais são necessárias. A experimentação do microarray envolve diversas etapas: projeto da biblioteca do ADN, preparação da microplaqueta, emperramento do alvo da proteína, rotulagem fluorescente, e exploração….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pela ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (subvenção n º 1023/18).

Materials

40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

References

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).
  11. Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).
  12. Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).

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Cite This Article
Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

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