الكبار الماوس أرقام بتر وتجديد: نموذج بسيط للتحقيق في تكوين بلاسيما الثدييات والتحجر intramembranous
Summary
هنا، نقدم بروتوكول اعادة الاستئصال الطرفية للفأر الكبار للتحقيق في تكوين الببلاسيما الثدييات وتحجر داخل الهستيرين، وتحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتتابع في الجسم الحي التصوير المقطعي المجهري.
Abstract
هنا، نقدم بروتوكول من الكبار الماوس البعيدة محطة phalanx (P3) بتر، نموذج الثدييات بسيطة إجرائيا واستنساخها من التجدد epimorphic، والذي ينطوي على تشكيل blastema والتحجر داخل التحجر تحليلها من قبل الكيمياء المناعية الفلورية والتصوير المقطعي المجهري المتسلسل في الجسم الحي (μCT). ويقتصر تجديد الثدييات على عمليات بتر الأطراف التي تنقل المنطقة البعيدة من الفالانكس الطرفي (P3)؛ الأرقام المبتورة في مستويات أكثر شبه ية تفشل في تجديد والخضوع للشفاء الليفي وتشكيل ندبة. يتم التوسط في استجابة التجديد عن طريق تشكيل انفجار التكاثري، تليها تجديد العظام عن طريق التحجر داخل العظام لاستعادة طول الهيكل العظمي المبتور. P3 بتر هو نموذج ما قبل السريرية للتحقيق في التجدد الشكلي في الثدييات، وهو أداة قوية لتصميم الاستراتيجيات العلاجية لاستبدال الشفاء الليفي مع استجابة تجديدية ناجحة. يستخدم بروتوكولنا الكيمياء المناعية الفلورية إلى 1) تحديد مجموعات الخلايا البلاسالتيما في وقت مبكر ومتأخر، 2) إعادة الأوعية الدموية في سياق التجدد، و 3) التحقيق في التحجر داخل العظام دون الحاجة إلى العظام المعقدة أجهزة التثبيت. كما نبرهن على استخدام التسلسلة في الجسم الحي μCT لإنشاء صور عالية الدقة لدراسة التغيرات المورفولوجية بعد البتر، فضلا عن قياس حجم وطول التغيرات في نفس الرقم على مدى التجديد. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر فائدة هائلة للتحقيق في كل من الاستجابات النضوجية والأنسجة التجديدية في الثدييات.
Introduction
الثدييات، بما في ذلك البشر والفئران، لديها القدرة على تجديد نصائح من أرقامها بعدبتر القاصي للphalanx الطرفية (P3) 1،2،3. في الفئران، استجابة التجديد تعتمد على مستوى البتر; عمليات بتر الأرقام القريبة بشكل متزايد تظهر استجابة تجديدية مخففة تدريجيًا حتى فشل تجديدي كامل عند بتر الأطراف وتنتقل والقريبة إلى مصفوفة الأظافر P34و5و6 , 7 , 8.يتم التوسط تجديد P3 عن طريق تشكيل blastema، ويعرف بأنه مجموعة من الخلايا المتكاثرة التي تخضع لمورفوجينيسيس لتجديد الهياكل المبتورة9. تشكيل blastema لتجديد الهياكل المفقودة عن طريق بتر، وهي عملية تسمى تجديد شكلي، يميز استجابة تجديد P3 متعددة الأنسجة المستوى من إصلاح الأنسجة التقليدية بعد الإصابة6، 10.P3 التجديد هو نموذج قابل للاستنساخ وبسيطة إجرائيا للتحقيق في العمليات التجديدية المعقدة بما في ذلك التئام الجروح11،12، الانحلال العظام11،12، إعادة الأوعية الدموية13، تجديد العصب المحيطي14، والتحويل الكيسي إلى العظام عن طريق التحجر داخل الأوعية15.
وقد أظهرت الدراسات السابقة باستخدام الكيمياء المناعية أن الانفجار غير متجانسة، والأوعية الدموية، نقص الأكسجة، والانتشار الشديد11،13،15،16. بعد بتر P3 القاصي، ويرتبط في البداية blastema في وقت مبكر مع periosteum P3 وendosteum ويتميز انتشار قوي وosteogenesis الوليدة المتاخمة لسطح العظام15. بعد تدهور العظام وإغلاق الجرح، يتم تشكيل الانفجار غير المتجانس من خلال دمج الخلايا المرتبطة بسرقة البيريوسرقة وendosteal، تليها التمايز بين المكونات الفجائية بما في ذلك العظام عن طريق التحجر داخل التحجر 15.
إصلاح العظام استجابة للإصابة يحدث عادة عن طريق التحجر endochondral، أي عن طريق الكالس الغضروفي الأولي الذي يشكل نموذجا لتشكيل العظام اللاحقة17،18. التحجر العظام طويلة intramembranous، أي تشكيل العظام دون وسيط ة غضروفية، ويحدث عادة باستخدام أجهزة الهاء معقدة أو التثبيت الجراحي19،20. استجابة تجديد الأرقام هو نموذج ما قبل السريرية التي تقدم مزايا على نماذج التحجر داخل memembranous التقليدية: 1) أنها لا تتطلب الخارجية أو الداخلية إصابة ما بعد التثبيت لتحفيز التحجر داخل، 2) فمن يتم تنفيذها باستخدام 4 أرقام من كل الحيوان، وبالتالي تعظيم العينات مع التقليل من استخدام الحيوانات، و 3) متسلسلة في التصوير المقطعي المجهري الجسم (μCT) يمكن أن يتم تحليل بسهولة وسرعة.
في هذه الدراسة، نبين طائرة البتر P3 الموحدة لتحقيق استجابة تجديد قابلة للاستنساخ وقوية. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بإظهار بروتوكول الكيمياء المناعية الفلورية الأمثل باستخدام أقسام البارافين لتصور تشكيل blastema، وإعادة الأوعية الدموية في سياق التجدد، وتحويل blastemal إلى العظام عن طريق داخل الباالتخزينان التحجر. كما نبرهن على استخدام التغيرات المتسلسلة في الجسم الحي لتحديد التغيرات في مورفولوجيا العظام وحجمها وطولها في نفس الرقم على مدى التجدد. والهدف من هذا البروتوكول هو التحقيق في تكوين الببلاسيما الثدييات بعد بتر الأطراف وإظهار 2 تقنيات، الفلورة الكيمياء المناعية ومتسلسلة في الجسم الحي μCT، لدراسة تجديد العظام intramembranous.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول إجراءً موحداً لبتر P3 القاصي للماوس البالغين، وتلطيخ الفلورسنت المناعي الكيميائي لتصور وتحرّي تشكيل البلازيما والتحجر داخل الجسم، والمسح المتسلسل داخل الجسم والأشعة المقطعية إلى تحديد العظام المورفولوجية، وحجم، وطول التغييرات بعد البتر. P3 بتر هو نموذج فريد من نوعه، ب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر مونيوكا ومعهد تكساس للطب الجينومي (TIGM). وقد تم دعم هذا العمل من قبل جامعة تكساس A & M.
Materials
| Protein Block Serum Free | DAKO | X0909 | Ready to use |
| Mouse anti-PCNA antibody | Abcam | ab29 | 1:2000 dilution |
| Rat anti-CXCR4 antibody | R&D Systems | MAB21651 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-human vWF XIII antibody | DAKO | A0082 | 1:800 dilution |
| Rabbit anti-osterix, SP7 antibody | Abcam | ab22552 | 1:400 dilution |
| Rabbit anti-Runx2 antibody | Sigma-Aldrich Co. | HPA022040 | 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21235 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11008 | 1:500 dilution |
| Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | 1:500 dilution |
| Prolong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36930 | Ready to use |
| Surgipath Decalicifier 1 | Leica Biosystems | 3800400 | Ready to use |
| Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative | Anatech LTD | 174 | Ready to use |
| CD-1 Female Mouse | Envigo | ICR(CD-1) | 8-12-weeks-old |
| vivaCT 40 | SCANCO Medical |
References
- Douglas, B. S. Conservative management of guillotine amputation of the finger in children. Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).
- Illingworth, C. M. Trapped fingers and amputated finger tips in children. Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Neufeld, D. A., Zhao, W. Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation. Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. 发育生物学. 315, 125-135 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Chamberlain, C. S., et al. Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx. Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).
- Dawson, L. A., et al. Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice. Regeneration. 3, 39-51 (2016).
- Seifert, A. W., Muneoka, K. The blastema and epimorphic regeneration in mammals. 发育生物学. 433, 190-199 (2018).
- Carlson, B. M. . Principles of Regenerative Biology. , (2007).
- Fernando, W. A., et al. Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice. 发育生物学. 350, 301-310 (2011).
- Simkin, J., et al. Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration. Regeneration. 2, 106-119 (2015).
- Yu, L., et al. Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration. Regeneration. 1, 33-46 (2014).
- Dolan, C. P., et al. Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice. 发育生物学. 445, 237-244 (2018).
- Dawson, L. A., et al. Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).
- Sammarco, M. C., et al. Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).
- Einhorn, T. A. The science of fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).
- Shapiro, F. Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts. European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).
- Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine. Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).
- Lee, J., et al. SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2. 发育生物学. 382, 98-109 (2013).
- Doube, M., et al. BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ. Bone. 47, 1076-1079 (2010).
