Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation d'blastema de mammifères et l'ossification intramembrane

Summary

Ici, nous présentons un protocole de l’amputation de phalange terminale de souris adulte pour étudier la formation de blastma de mammifères et l’ossification intramembrane, analysée par l’immunohistochemistry fluorescent et la tomographie microcomputed in-vivo séquentielle.

Abstract

Ici, nous présentons un protocole de la phalange terminale adulte de souris (P3) amputation, un modèle mammifère procéduralement simple et reproductible de régénération épimorphe, qui implique la formation de blastma et l’ossification intramembrane analysée par immunohistochemistry de fluorescence et tomographie microcomputée in vivo séquentielle (CT). La régénération des mammifères est limitée aux amputations transectant la région distale de la phalange terminale (P3); les chiffres amputés à des niveaux plus proximal s’échouent et subissent la guérison fibrotique et la formation de cicatrices. La réponse de régénération est médiée par la formation d’un blastème proliférant, suivi de la régénération d’os par l’ossification intramembrane pour reconstituer la longueur squelettique amputée. L’amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique chez les mammifères, et est un outil puissant pour la conception des stratégies thérapeutiques pour remplacer la guérison fibrotique par une réponse régénérative réussie. Notre protocole utilise l’immunohistochimie de fluorescence pour 1) identifier les populations tôt et tard de cellules de blastma, 2) la revascularisation d’étude dans le contexte de la régénération, et 3) étudier l’ossification intramembrane sans avoir besoin d’os complexe dispositifs de stabilisation. Nous démontrons également l’utilisation de l’in vivo séquentiel pour créer des images haute résolution pour examiner les changements morphologiques après l’amputation, ainsi que pour quantifier les changements de volume et de longueur dans le même chiffre au cours de la régénération. Nous croyons que ce protocole offre une utilité énorme pour étudier les réponses épimorphiques et régénératrices tissulaires chez les mammifères.

Introduction

Les mammifères, y compris les humains et les souris, ont la capacité de régénérer les pointes de leurs chiffres après l’amputation distale de la phalange terminale (P3)^1,2^,3. Chez la souris, la réponse de régénération est dépendante de l’amputation; les amputations de chiffre de plus en plus proximales affichent une réponse régénérative progressivement atténuée jusqu’à l’échec régénératif complet aux amputations transectant et proximal à la matrice d’ongle de P3^{4,5,6 , 7 Annonces , 8}. La régénération de P3 est médiée par la formation d’un blastma, défini comme une population de cellules proliférantes qui subissent la morphogénèse pour régénérer les structures amputées⁹. La formation d’un blastma pour régénérer les structures perdues par amputation, un processus appelé régénération épimorphe, distingue la réponse de régénération P3 multi-tissu-niveau de la réparation traditionnelle de tissu après blessure^{6, 10}. La régénération de P3 est un modèle reproductible et procéduralement simple pour étudier les processus régénératifs complexes comprenant la guérison de blessure^11,12, histolyse d’os^11,12, revascularisation¹³, régénération nerveuse périphérique¹⁴, et conversion blastmalà l’os par ossification intramembrane1 .

Des études antérieures utilisant l’immunohistochimie ont démontré que le blastema est hétérogène, avascular, hypoxique, et fortement proliférant^11,13,15,16. Après l’amputation distale de P3, le blastema tôt est au commencement associé au périosteum et à l’endosteum de P3 et est caractérisé par la prolifération robuste et l’ostéogenèse naissante adjacente à la surface d’os^15. Après la dégradation d’os et la fermeture de blessure, le blastma hétérogène est formé par la fusion des cellules periosteal et endosteal-associées, suivie par la différenciation des composants blastmal comprenant l’os par l’ossification ^{intramembrane 15}.

La réparation osseuse en réponse à des blessures se produit généralement par ossification endochondrale, c’est-à-dire par l’intermédiaire d’un callus cartilagineux initial qui forme un modèle pour la formation osseuse ultérieure^17,18. L’ossification intramembrane à long os, c.-à-d., formation d’os sans intermédiaire cartilagineux, est généralement induite utilisant des dispositifs complexes de distraction ou la fixation chirurgicale^19,20. La réponse de régénération de chiffre est un modèle préclinique qui offre des avantages au-dessus des modèles conventionnels d’ossification intramembrane : 1) il n’exige pas la blessure externe ou interne de poteau de fixation pour stimuler l’ossification intramembrane, 2) il est réalisée à l’aide de 4 chiffres de chaque animal, maximisant ainsi les échantillons tout en minimisant l’utilisation des animaux, et 3) l’analyse de la tomographie microcomputée in vivo séquentielle peut être effectuée avec facilité et rapidité.

Dans la présente étude, nous montrons le plan standardisé d’amputation de P3 pour réaliser une réponse reproductible et robuste de régénération. En outre, nous démontrons un protocole optimisé d’immunohistochemistry de fluorescence utilisant des sections de paraffine pour visualiser la formation de blastma, la revascularisation dans le contexte de la régénération, et la conversion blastmal à l’os par l’intermédiaire intramembranous Ossification. Nous démontrons également l’utilisation de l’invivo séquentiel pour identifier des changements dans la morphologie, le volume, et la longueur d’os dans le même chiffre au cours de la régénération. L’objectif de ce protocole est d’étudier la formation de blastma mammifère après l’amputation et de démontrer 2 techniques, l’immunohistochemistry de fluorescence et le TCT in vivo séquentiel, pour l’étude de la régénération osseuse intramembrane.

Protocol

Toutes les techniques et l’utilisation des animaux étaient conformes aux procédures d’exploitation standard du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Texas A et M. 1. Adulte Souris Hind Limb Distal P3 Amputation Anesthésiez une souris CD-1 de 8 à 12 semaines (Tableaudes matériaux)en utilisant du gaz isoflurane dans l’oxygène; d’abord anesthésier à 3% dans une chambre, suivie de 2% isoflurane fourni par un cône de nez su…

Representative Results

La souris adulte régénérant des chiffres P3 à 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Figure 2E-H), et 10 DPA (Figure 2I-L) ont été immunostained avec des anticorps à Runx2, OSX, et PCNA pour visualiser l’os intramembrane la régénération, et immunostained avec des anticorps à CXCR4 et vWF pour visualiser la formation de blastma. Les rendus représentatifs de la CT des chiffres num?…

Discussion

Ce protocole décrit une procédure normalisée de l’amputation distale de P3 de souris adulte, de la coloration immunohistochemical fluorescente pour visualiser et étudier la formation de blastma et l’ossification intramembrane, et le balayage in-vivo séquentieux de CT à identifier les changements morphologiques, de volume et de longueur d’os après l’amputation. L’amputation de P3 est un modèle unique, procéduralement simple, et reproductible pour analyser un environnement pro-régénératif de blessure qui décle…

Materials

Protein Block Serum Free	DAKO	X0909	Ready to use
Mouse anti-PCNA antibody	Abcam	ab29	1:2000 dilution
Rat anti-CXCR4 antibody	R&D Systems	MAB21651	1:500 dilution
Rabbit anti-human vWF XIII antibody	DAKO	A0082	1:800 dilution
Rabbit anti-osterix, SP7 antibody	Abcam	ab22552	1:400 dilution
Rabbit anti-Runx2 antibody	Sigma-Aldrich Co.	HPA022040	1:250 dilution
Alexa Fluor 647-conjugated goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21235	1:500 dilution
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A11008	1:500 dilution
Alexa Fluor 568-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Invitrogen	A11077	1:500 dilution
Prolong Gold antifade reagent	Invitrogen	P36930	Ready to use
Surgipath Decalicifier 1	Leica Biosystems	3800400	Ready to use
Z-Fix, Aqueous buffered zinc formalin fixative	Anatech LTD	174	Ready to use
CD-1 Female Mouse	Envigo	ICR(CD-1)	8-12-weeks-old
vivaCT 40	SCANCO Medical