Verwendung von Alu-Element enthaltenden Minigenes zur Analyse von kreisförmigen RNAs
Summary
Wir klonen und analysieren Reportergene, die kreisförmige RNAs erzeugen. Diese Reportergene sind größer als Konstrukte, um lineare Spleißungen zu analysieren und Alu-Elemente zu enthalten. Zur Untersuchung der kreisförmigen RNAs werden die Konstrukte in Zellen transfiziert und die resultierende RNA wird mit RT-PCR nach Entfernung linearer RNA analysiert.
Abstract
Neben linearen mRNAs erzeugen viele eukaryotische Gene kreisförmige RNAs. Die meisten kreisförmigen RNAs werden generiert, indem eine 5′ Spleißstelle mit einer vorgelagerten 3′ Spleißstelle innerhalb einer Pre-mRNA, einem Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird, angeschlossen wird. Diese Zirkularisierung wird wahrscheinlich durch sekundäre Strukturen in der Pre-mRNA unterstützt, die die Spleißstellen in die Nähe bringen. In menschlichen Genen werden Alu-Elemente gedacht, um diese sekundären RNA-Strukturen zu fördern, da Alu-Elemente reichlich vorhanden sind und Basiskomplementaritäten miteinander aufweisen, wenn sie in entgegengesetzten Richtungen in der Pre-mRNA vorhanden sind. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Analyse großer Alu-Elemente, die Reportergene enthalten, die kreisförmige RNAs bilden. Durch die Optimierung von Klonprotokollen können Reportergene mit bis zu 20 kb Insert-Länge erzeugt werden. Ihre Analyse in Co-Transfektionsexperimenten ermöglicht die Identifizierung regulatorischer Faktoren. So kann diese Methode RNA-Sequenzen und zelluläre Komponenten identifizieren, die an der kreisförmigen RNA-Bildung beteiligt sind.
Introduction
Zirkuläre RNAs
Circular RNAs (circRNAs) sind kovalent geschlossene einsträngige RNAs, die in den meisten Organismen exprimiert werden. Sie werden erzeugt, indem sie eine nachgelagerte 5′ Spleißstelle zu einem vorgelagerten 3′ Spleißstandort verbinden, ein Prozess, der als Back-Spleicing bezeichnet wird (Abbildung 1A)1. Sequenzen in der Pre-mRNA, die eine Basis komplementär wie 30-40 nt aufweisen, bringen Back-Splice-Sites in die richtige Ausrichtung für die zirkRNA-Bildung2. Beim Menschen bilden Alu-Elemente 1, die etwa 11% des Genoms3darstellen, aufgrund ihrer Selbstkomplementärität4,5 umfangreiche doppelsträngige RNA-Strukturen in pre-mRNA und fördern damit die Bildung von CircRNAs1.
Derzeit wurden drei Hauptfunktionen von circRNAs beschrieben. Einige circRNAs binden microRNAs (miRNAs) und wirken durch Sequestrierung wie miRNA Schwämme6. CircRNAs wurden in die transkriptionelle und posttranskriptionelle Regulierung, durch Wettbewerb mit linearer Spleißung7 oder Modulation der Transkriptionsfaktoraktivität8verwickelt. Schließlich enthalten circRNAs kurze offene Leserahmen und Grundsatzstudien zeigen, dass sie9,10übersetzt werden können. Die Funktion der meisten circRNAs bleibt jedoch rätselhaft. Die meisten zirkulären RNAs wurden mit den Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation11erkannt. Detaillierte Analysen einzelner Gene mit gezielten RT-PCR-Ansätzen zeigen, dass eine große Anzahl von kreisförmigen RNAs noch entdeckt werden muss12.
Einsatz von Reportergenen zur Analyse der Pre-mRNA-Verarbeitung
Die Analyse von mRNA, die von DNA-Reporterkonstrukten abgeleitet wurde, die in Zellen transfiziert werden, ist eine etablierte Methode zur Untersuchung alternativer Pre-mRNA-Spleißungen, die auf kreisförmige RNAs angewendet werden können. Im Allgemeinen werden das alternative Exon, seine umgebenden Introns und konstitutive Exons verstärkt und zu einem eukaryotischen Expressionsvektor geklont. Häufig werden die Introns verkürzt. Die Konstrukte werden in eukaryotische Zellen transfiziert und in der Regel von RT-PCR13,14analysiert. Dieser Ansatz wurde ausgiebig verwendet, um regulatorische Spleißstellen und transacting Faktoren in Co-Transfektionsexperimenten13,15,16,17,18zu kartieren. Darüber hinaus ermöglichte die Erzeugung von proteinexstigen Minigenen das Screening von Substanzen, die alternative Spleißen ändern19,20.
Die Methode wurde auf zirkuläre RNAs angewendet. Derzeit sind mindestens 12 Minigen-Rückgrate in der Literatur beschrieben und in Tabelle 1zusammengefasst. Mit Ausnahme des tRNA-basierten Expressionssystems21,22sind sie alle von Polymerase-II-Promotoren abhängig. Hier beschreiben wir eine Methode zur Generierung menschlicher Reporter-Minigene, um cis und trans-acting Faktoren zu bestimmen, die an der Erzeugung von kreisförmigen RNAs beteiligt sind. Eine Übersicht über die Methode anhand von Sequenzen eines veröffentlichten Reportergens23 ist in Abbildung 1dargestellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Allgemeinen sind kreisförmige RNAs niedrig reichlich1, was die Untersuchung ihrer Funktion und Bildung erschwert. Ähnlich wie bei linearen RNAs13ermöglicht die Verwendung von Reporter-Minigenes die Identifizierung von cis und trans-wirkenden Faktoren, die die Bildung von kreisförmigen RNAs regulieren. So erzeugt dieser Ansatz Hypothesen, die mit den endogene Genen weiter getestet werden können.
Der wichtigste Schritt ist das Design des Re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom DoD-Zuschuss des Verteidigungsministeriums AZ180075 unterstützt. Stefan Stamm dankt Jacqueline Noonan Endowment. Unterstützt wurde Anna Pawluchin vom DAAD, dem deutschen akademischen Austauschprogramm, Justin R. Welden erhielt den Max Steckler Award der University of Kentucky.
Materials
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
| Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
| Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
| Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
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