Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari
Summary
Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l’RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell’RNA lineare.
Abstract
Oltre agli mRNA lineari, molti geni eucarioti generano RNA circolari. La maggior parte degli RNA circolari sono generati dall’unendo un sito di giunzione di 5′ con un sito di giunzione a monte a monte di 3′ all’interno di un pre-mRNA, un processo chiamato back-splicing. Questa circolarizzazione è probabilmente aiutata da strutture secondarie nel pre-mRNA che portano i siti di giunzione in stretta vicinanza. Nei geni umani, si pensa che gli elementi alu promuovano queste strutture secondarie dell’RNA, poiché gli elementi Alu sono abbondanti e presentano complementarità di base tra loro quando sono presenti in direzioni opposte nel pre-mRNA. Qui, descriviamo la generazione e l’analisi di grandi elementi Alu contenenti geni reporter che formano RNA circolari. Attraverso l’ottimizzazione dei protocolli di clonazione, è possibile generare geni reporter con una lunghezza di inserto fino a 20 kb. La loro analisi negli esperimenti di co-trasfezione consente l’identificazione di fattori normativi. Pertanto, questo metodo può identificare le sequenze di RNA e i componenti cellulari coinvolti nella formazione circolare dell’RNA.
Introduction
RNA circolari
Gli RNA circolari (circRNA) sono rna a singolo spiaggiamento chiusi covalentmente chiusi che sono espressi nella maggior parte degli organismi. Vengono generati unendo un sito di giunzione a un downstream 5′ a un sito di giunzione a monte 3′, un processo chiamato back-splicing (Figura 1A)1. Le sequenze nel pre-mRNA che presentano una base complementare fino a 30-40 nt portano i siti di giunzione posteriore in un corretto allineamento per la formazione di circRNA2. Nell’uomo, gli elementi Alu 1, che rappresentano circa l’11% del genoma3, formano ampie strutture di RNA a doppio filamento nel pre-mRNA a causa della loro auto-complementarità4,5 e quindi promuovono la formazione di circRNA1.
Attualmente, sono state descritte tre funzioni principali dei circRNA. Alcuni circRNA legano microRNA (miRNA) e attraverso il sequestro agiscono come spugne di miRNA6. I circRNA sono stati implicati nella regolazione trascrizionale e post trascrizionale, attraverso la concorrenza con la giunzione lineare7 o la modulazione dell’attività del fattore di trascrizione8. Infine, i circRNA contengono brevi cornici di lettura aperte e studi di prova di principio dimostrano che possono essere tradotti9,10. Tuttavia, la funzione della maggior parte dei circolrRNA rimane enigmatica. La maggior parte degli RNA circolari è stata rilevata utilizzando i metodi di sequenziamento di nuova generazione11. Analisi dettagliate di singoli geni utilizzando approcci RT-PCR mirati rivelano che un gran numero di RNA circolari rimane da scoprire12.
Uso dei geni dei reporter per analizzare l’elaborazione pre-mRNA
L’analisi dell’mRNA derivato dai costrutti di segnalazione del DNA trasinfezione in cellule è un metodo ben consolidato per studiare lo splicing pre-mRNA alternativo, che può essere applicato agli RNA circolari. In generale, l’eson alternativo, gli introni circostanti e gli estrusioni coniugali vengono amplificati e clonati in un vettore di espressione eucatra. Spesso, gli introni sono accorciati. I costrutti sono trasfettati in cellule eucariotiche e di solito analizzati da RT-PCR13,14. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per mappare i siti di giunzione regolamentare e i fattori di trans-azione negli esperimenti di co-trasfezione13,15,16,17,18. Inoltre, la generazione di minigeni proteici ha permesso lo screening di sostanze che cambiano lo splicing alternativo19,20.
Il metodo è stato applicato agli RNA circolari. Attualmente, almeno 12 backbone minigene sono stati descritti nella letteratura e sono riassunti nella tabella 1. Ad eccezione del sistema di espressione basato sul tRNA21,22, tutti dipendono dai promotori di polimerasi II. Qui, descriviamo un metodo per generare minigeni di reporter umani per determinare i fattori di cis e trans-azione coinvolti nella generazione di RNA circolari. Una panoramica del metodo che utilizza sequenze di un reporter genepubblicato 23 è illustrata nella Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
In generale, gli RNA circolari sono bassi abbondanti1, il che complica lo studio della loro funzione e formazione. Simile agli RNA lineari13, l’uso di minigeni reporter permette l’identificazione di cis e fattori trans-agire che regolano la formazione di RNA circolari. Pertanto, questo approccio genera ipotesi che possono essere ulteriormente testate utilizzando i geni endogeni.
Il passo più critico è la progettazione del gene reporter. L’assem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento della Difesa DoD grant A-180075. Stefan Stamm ringrazia Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin è stata supportata dal DAAD, programma di scambio accademico tedesco, Justin R. Welden ha ricevuto il premio Max Steckler Award dell’Università del Kentucky.
Materials
| (PEI) Hydrochloride | Polysciences | 24765-1 | |
| Builder tool | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Dark Reader Transilluminator. | Clare Chemical Research | ||
| Enzymatic DNA assembly kit | NEB | E2621S | |
| Gel and PCR cleanup kit | Promega | A9282 | |
| Glyco Blue | Thermo Fisher | AM9516 | |
| pcDNA3.1 cloning site | Polycloning site | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf | |
| Polymerase 1 | NEB | M0491L | Q5 DNA polymerase |
| Polymerase 2 | Biorad | 1725310 | Long range polymerase (NEB), iproof (BioRad) |
| Polymerase 2 | Qiagen | 206402 | Qiagen long range polymerase kit |
| Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18080044 | |
| RNA isolation kit | Life Technologies | 12183025 | Ambion by Life Technologies |
| RNAse R | Lucigen | RNR07250 | Epicenter/Lucigen |
| Stable competent cells | NEB | C3040H | NEB stable cells |
| Standard cloning bacteria | NEB | C2988J | NEB5-alpha competent |
| Web tool to design primers | NEB | https://nebuilder.neb.com/#!/ | |
| Web-based temperature calculations | NEB | https://tmcalculator.neb.com/#!/main |
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