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癌症研究

実用的で実現可能な方法のセットを使用してRAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けます

Published: July 17, 2019
doi:
10.3791/59795
, , , , ,
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research,National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program,Duke-NUS Medical School

Summary

本稿では、インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および相補的なスプリットルシフェラーゼアッセイを含む、RAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けるための実用的かつ実行可能な方法のセットを提示した。

Abstract

急速に加速した線維全腫(RAF)ファミリーキナーゼは細胞生物学において中心的な役割を果たし、その機能不全は癌および発達障害につながる。疾患関連のRAF変異体の特徴付けは、これらの疾患を治療するための適切な治療戦略を選択するのに役立ちます。最近の研究では、RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、これは二層化によって厳しく規制されている。ここでは、触媒およびアロステリック活性とRAFファミリーキナーゼとその変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を決定するための実用的かつ実行可能な方法のセットを構築した。まず、バッファー内の洗剤濃度を低減し、緩やかなクイックウォッシュ手順を利用し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合を採用して、RAFダイマーの解離を防ぐことで、古典的なインビトロキナーゼアッセイを修正しました。浄化。これにより、構成的に活性なRAF変異体の触媒活性を適切に測定することができる。第二に、N末端切り捨てられたRAFタンパク質を用いてキナーゼ死死性RAF変異体のアロステリック活性を評価する新規RAF共活性化アッセイを開発し、現在のプロトコルにおける活性Rasの要件を排除し、より高いレベルを達成した。感度。最後に、我々は、従来の共免疫沈殿アッセイと比較して、より信頼性が高く、敏感である様々なRAF変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を定量的に測定するために、ユニークな相補的な分割ルシフェラーゼアッセイを生成しました。要約すると、これらの方法には、(1) ユーザーフレンドリーな利点があります。(2)高度な機器なしで効果的に行うことができる。(3) 費用対効果が高い。(4)高感度で再現性が高い。

Introduction

RAFファミリーキナーゼは、RAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達カスケードの重要な構成要素であり、RASからのシグナルを伝達してミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MEK)1、2、3、4を活性化します。キナーゼのこのファミリーは、細胞の増殖、生存および分化に重要な役割を果たし、その変化は多くの疾患、特に癌5、6、7、8を誘発する。近年、ゲノムシーケンシングは、RAS/RAF/MEK/ERKカスケード9、10、11のシグナル伝達において異なる特性を示す多くの疾患関連RAF変異体を同定した。RAF変異体の慎重な特徴付けは、RAF変異体がRAS/RAF/MEK/ERKカスケードの信号出力を変化する方法の分子メカニズムを理解するのに役立ち、最終的には様々なRAF変異体駆動疾患を治療するための適切なアプローチを選択する。

RAFファミリーキナーゼは、CRAF、BRAF、およびARAFの3つのメンバーを含み、同様の分子構造を有するが、下流シグナル伝達1、2、3、4を活性化する能力が異なる。これらのパラログの中で、BRAFは、その構成的にリン酸化されたNtA(N -t erminal acidic)モチーフ12、13、14、ARAFが最も低いのに対して、最も高い活性を有する。その非正規APEモチーフ15から生じる活動.これは、疾患におけるRAFパラログの異なる突然変異周波数を説明するかもしれません: BRAF>CRAF>ARAF.さらに、同じRAFパラログ内で、異なる部位の突然変異が異なる方法で下流シグナリングを引き起こす可能性があり、これはRAFファミリーキナーゼの調節に複雑さの別の層を追加します。最近の研究は、すべてのRAFキナーゼが触媒およびアロステリック活性の両方を持っていることを実証しています13,14,16,17,18.構成的にアクティブなRAF変異体は、MEKをリン酸化することによって下流シグナリングを直接オンにするのに対し、キナーゼ死んだRAF変異体は、左右のダイマライゼーションを通じて野生型の変異体を転移させ、MEK-ERKシグナリング16を活性化することができます。 、19、20.ダイマーアフィニティ/安定性は、キナーゼ死んだRAF変異体のアロステリック活性を決定するだけでなく、構成的に活性なRAF変異体15、21の触媒活性に影響を与える重要なパラメータです。22.ダイマー親和性/安定性の高いキナーゼ死血RAF変異体は、内因性野生型AFを直接15をトランス活性化することができ、中間ダイマー親和性/安定性を有するものは、活性Rasまたは機能する野生型RAF分子の上昇レベル13,15,20,21,23.同様に、構成的に活性なRAF変異体は、ダイマー依存的な方法でMEKをリン酸化し、弱いRAFダイマー15を破壊する免疫沈殿時にインビトロでの触媒活性を失う。 21、22。ダイマーアフィニティ/安定性はまた、それらの阻害剤に対するRAF変異体の感受性を決定し、そしてRAF阻害剤24の耐性に正に相関する。したがって、疾患関連のRAF変異体を特徴付けるためには、触媒およびアロステリック活性、およびダイマー親和性/安定性を測定する必要がある。

近年、当研究室等では、RAFファミリーキナーゼとその変異体を特徴付ける様々な方法を開発しています。当研究室や他者の経験によると、以下の3つのアッセイは、疾患関連のRAF変異体を定義する上で有利であると考えています:(1)構成的に触媒活性を容易に検出できるインビトロキナーゼアッセイアクティブRAF変異体15;(2)キナーゼ死存RAF変異体13、15、21、22、23のアロステリック活性を測定するための信頼性が高く便利な方法であるRAF共活性化アッセイ25;(3)従来の共免疫沈殿アッセイとは対照的に、RAF変異体の相対的な薄暗い親和性/安定性を測定する上ではるかに高い感度を有し、かつ高度な装置なしで行うことができる無料のスプリットルシフェラーゼアッセイSPR(Surface PラスモンRエソナンス)分析15、22などの定量分析方法とは対照的である。 これら3つのアッセイを組み合わせることで、疾患関連のRAF変異体が下流シグナル伝達をどのように変化させるかを容易に理解し、このRAF変異によって引き起こされる疾患を治療するための適切な治療戦略を利用することができます。

Protocol

RAF変異体の触媒活性を測定するためのインビトロキナーゼアッセイ ギブソンアセンブリまたは従来の分子クローニング法を用いて、C終産でFLAG(DYKDDK)タグを用いてRAF変異体(図1A)をコードするベクターを構築する。 FLAGタグと変異をPCRによるRAFコード配列に導入し、ギブソンアセンブリまたはT4 DNAライゲーションを使用してpCDNA3.1(+)ベクターに?…

Representative Results

RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、疾患関連変異体が異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達をオンにすることを可能にする 、18.構成的に活性なRAF変異体は基質を直接リン酸化し、キナーゼ死死性RAF変異体は野生型?…

Discussion

本稿では,インビトロキナーゼアッセイ,RAF共活性化アッセイ,無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを含む疾患関連RAF変異体を特徴付けるための3つの方法を紹介した.RAFキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有するので、様々なRAF変異体は、2つの異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達を活性化することができます。</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、元ジミンの支援のための毛深い細胞白血病フェローシップを認めたい。この研究は、アジアファンドがん研究(AFCR2017/2019-JH)、デューク-NUSクーブリッジファンディングアワード(デューク-NUS-KBrFA/2018/0014)、NCCRFブリッジ助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(N研究助成金(AM/TP011/2018)

Materials

anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041
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References

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Keywords: RAF KinaseDisease-related MutantsCharacterizationCatalytic ActivityFlag-taggedGlutathione S-transferase293T CellsLysis BufferAnti-FLAG Affinity BeadsKinase ReactionSDS-PAGEImmunoblot
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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).
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