Summary

실용적이고 실행 가능한 방법 세트를 사용하여 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이 특성화

Published: July 17, 2019
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Summary

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.

Abstract

급속하게 가속화된 섬유육종 (RAF) 가족 키나아제는 세포 생물학에 있는 중앙 역할을 하고 그들의 역기능은 암과 발달 무질서로 이끌어 냅니다. 질병 관련 RAF 돌연변이체의 특성화는 우리가 이 질병 취급을 위한 적당한 치료 전략을 선택하는 것을 도울 것입니다. 최근 연구에 따르면 RAF 패밀리 키나아제는 촉매 작용과 알로스테릭 활동이 모두 있으며, 이는 이분화에 의해 엄격하게 조절됩니다. 여기에서, 우리는 촉매 및 allosteric 활동 및 RAF 가족 키나아제 및 그들의 돌연변이체의 상대적인 이량친 친화성/안정성을 결정하기 위하여 실용적이고 실행 가능한 방법의 세트를 건설했습니다. 첫째, 완충제의 세제 농도를 줄이고, 완만한 세척 절차를 활용하고, RAF 이분분석(GST) 융합을 사용하여 RAF 이완제 중 해리되는 것을 방지함으로써 고전적인 시험관내 키나아제 분석기를 개정했습니다. 정화. 이를 통해 우리는 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 적절히 측정할 수 있다. 둘째, N-말단 절단 된 RAF 단백질을 사용하여 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 평가하기 위한 새로운 RAF 공동 활성화 분석방법을 개발하여 현재 프로토콜에서 활성 Ras의 요구 사항을 제거하고 더 높은 것을 달성했습니다. 감도. 마지막으로, 우리는 전통적인 동면역침전 분석실험에 비해 더 안정적이고 민감한 다양한 RAF 돌연변이체의 상대적 이량친 친화성/안정성을 정량적으로 측정하기 위해 독특한 상보성 분할 루시페라아아제 분석법을 생성했다. 요약하자면, 이러한 방법에는 다음과 같은 장점이 있습니다: (1) 사용자 친화적인; (2) 고급 장비없이 효과적으로 수행 할 수; (3) 비용 효율적; (4) 매우 민감하고 재현 가능.

Introduction

RAF 계모 키나아제는 RAS/RAF/MEK/ERK 신호 캐스케이드의 핵심 구성 요소로, RAS로부터 신호를 전송하여 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MEK)1,2,3,4를활성화합니다. 키나아제의 이 가족은 세포 성장, 생존 및 분화에 중요한 역할을 하며, 이들의변화는 많은 질병, 특히 암 5,6,7,8을유발한다. 최근, 게놈 염기서열 분석은 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드9,10,11의신호 전송에 상이한 특성을 나타내는 많은 질병 관련 RAF 돌연변이체를 확인하였다. RAF 돌연변이체의 신중한 특성화는 RAF 돌연변이체가 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드의 신호 출력을 변경하는 방법의 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되며, 결국 다양한 RAF 돌연변이 구동 질환 치료에 적합한 접근법을 선택하는 데 도움이 됩니다.

RAF 패밀리 키나제는 3개의 멤버, CRAF, BRAF 및 ARAF를 포함하며, 이는유사한 분자 구조를 가지고 있지만 다운스트림 신호화 1,2,3,4를활성화하는 다른 능력을 가진다. 이러한 파라로그 중에서 BRAF는 인산화된 NtA(N –terminal acidic) 모티프12,13,14,ARAF가 가장 낮은 것으로 나타났습니다. 비 정식 APE 모티프에서 발생하는 활동15. 이것은 질병에 있는 RAF paralogs의 다른 돌연변이 주파수를 설명할 수 있습니다: BRAF>CRAF>ARAF. 더욱이, 동일 RAF paralog 내의, 다른 사이트에 있는 돌연변이는 RAF 가족 키나아제의 규칙에 복잡성의 또 다른 층을 추가하는 별개의 방식으로 다운스트림 신호를 시작할 수 있습니다. 최근 연구는 모든 RAF 키나제는 촉매 및 allosteric 활동모두 13,14,16,17,18을가지고 있음을 입증했다. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 MEK를 인산화하여 하류 신호를 직접 켜는 반면, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 좌우 이량화를 통해 야생 형 대응을 트랜스 활성화하고 MEK-ERK 신호 16을 활성화할 수 있습니다. ,19,20. 이량친 친화성/안정성은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 결정할 뿐만 아니라 조직적으로 활성RAF 돌연변이체(15,21)의 촉매 활성에 영향을 미치는 주요 파라미터이다. 22. 높은 이분화 친화성/안정성을 가진 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 내인성 야생형 RAF를 직접 15로 변환 할 수 있으며 중간 이량 친화성 / 안정성을 가진 돌연변이는 활성 Ras 또는 야생 형 RAF 분자의 높은 수준은 기능13,15,20,21,23. 유사하게, 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 이량체 의존적 방식으로 MEK를 인산화하고, 낮은 이량친 친화성/안정성을 가진 사람들은 약한 RAF 이동기를 깨뜨리는 면역 침전 시 시험관내에서 촉매 활성을 잃는다15, 21,22. 이량친친화성/안정성은 또한 그들의 억제제에 대한 RAF 돌연변이체의 민감도를 결정하고, RAF 억제제(24)의 내성에 긍정적으로 상관관계가 있다. 따라서 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하기 위해서는 촉매 및 알로스테릭 활동을 측정하고 친화성/안정성을 변화시켜야 합니다.

최근 몇 년 동안, 우리의 실험실 및 다른 RAF 가족 키나아제와 그들의 돌연변이를 특성화 하는 다양 한 방법을 개발 했다. 우리의 실험실 및 다른 사람의 경험에 따르면, 우리는 다음 세 가지 분석이 질병 관련 RAF 돌연변이를 정의하는 데 장점이 있다고 생각합니다: (1) 체외 키나아제 분석제는 구성적으로 촉매 활성을 검출하기 위해 쉽게 수행 될 수 있습니다. 활성 RAF돌연변이체 15; (2) RAF 공동 활성화 분석법은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체13,15,21, 22,23의알로스테릭 활성을 측정하는 안정적이고 편리한 방법이다. 25; (3) 기존의 동면역침전 분석과 는 달리 RAF 돌연변이체의 상대이량 친화성/안정성을 측정하는 데 훨씬 더 높은 감도를 가지며, 첨단 장비 없이도 수행할 수 있는 무료 분할 루시페라아제 분석 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석15,22와같은 정량적 분석 방법과는 대조적이다. 이 3개의 검사를 결합하는, 우리는 질병 관련 RAF 돌연변이가 어떻게 하류 신호를 바꾸는지 쉽게 이해할 수 있고, 그로 인하여 이 RAF 돌연변이에 기인한 질병을 취급하기 위하여 적당한 치료 전략을 이용하.

Protocol

1. RAF 돌연변이의 촉매 활동을 측정하기위한 체외 키나제 분석 Gibson 어셈블리 또는 기존분자 복제 방법을 사용하여 C-종단에서 RAF 돌연변이체(그림 1A)를 FLAG(DYKDDDDK) 태그로 코딩하는 벡터를 생성합니다. PRS에 의해 RAF 코딩 서열에 FLAG 태그 및 돌연변이를 소개하고, 깁슨 어셈블리 또는 T4 DNA 결찰을 사용하고 제조의 프로토콜을 따라 pCDNA3.1(+) 벡터에…

Representative Results

RAF 패밀리 키나아제는 촉매 및 알로스테릭 활동을 모두 가지고 있으며, 이는 질병 관련 돌연변이가 다른 메커니즘13,14,16,17을 통해 하류 신호를 켤 수 있게 합니다. ,18. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 직접 그들의 기질을 인산화하고, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 야생?…

Discussion

이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 무료 분할 루시페라아아제 분석법을 포함하는 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하는 세 가지 방법을 제시했습니다. RAF 키나아제는 촉매 활성과 알로스테릭 활성을 모두 갖기 때문에, 다양한 RAF 돌연변이체는 두 가지 메커니즘을 통해 다운스트림 신호를 활성화할 수 있다13,14,<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 위안 지민의 지원을 위한 털이 많은 세포 백혈병 동호회를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 아시아 펀드 암 연구 (AFCR2017 / 2019-JH), 듀크 누스 쿠 브릿지 자금 조달 상 (듀크 – NUS-KBrFA / 2018 / 0014), NCCRF 브리징 보조금 (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF 파일럿 보조금 (NCCRF-YR2017-2017)에 의해 지원되었습니다. 연구 보조금 (AM/ TP011/2018).

Materials

anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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