Summary

連鎖球菌変異体における高分子塊タンパク質の精製

Published: September 14, 2019
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Summary

ここで説明する、連鎖球菌変異体における遺伝子産物の精製のための簡単な方法である。この技術は、タンパク質、特に膜タンパク質および高分子量タンパク質の精製に有利であり、かつ様々な他の細菌種と共に使用することができる。

Abstract

遺伝子の機能の解明は、通常、目的の遺伝子が破壊された野生型株と株の表現型形質の比較を含む。遺伝子破壊後の機能の喪失は、その後、破壊された遺伝子の生成物の外因性添加によって回復される。これは、遺伝子の機能を決定するのに役立ちます。前述の方法は、gtfC遺伝子破壊連鎖球菌株を生成することを含む。ここで、遺伝子破壊に続いて新たに生成されたS.ミュータンからgtfC遺伝子産物を精製するための要求の厳しい方法が記載されている。目的の遺伝子の3’末端にポリヒスチジンコード配列を添加することを含み、固定化金属親和性クロマトグラフィーを用いて遺伝子産物を簡単に精製することができます。この方法では、PCR以外の酵素反応は必要ありません。遺伝子破壊後の外因性添加による遺伝子産物の回復は、遺伝子機能を決定するための効率的な方法であり、異なる種に適応することもできる。

Introduction

遺伝子の機能の分析は、通常、目的の遺伝子が破壊された株に野生型株の表現形質の比較を含む。遺伝子破壊株が産生されると、遺伝子産物の外因性添加が機能的回復を可能にする。

その後の修復アッセイに必要な精製遺伝子産物を得るための最も一般的な方法は、大腸菌1で異種発現を行うことである。しかしながら、膜タンパク質または高分子量タンパク質の発現は、このシステム1を用いて困難であることが多い。これらの場合、標的タンパク質は、通常、複雑な一連のステップを通じてタンパク質をネイティブに合成する細胞から単離され、遺伝子産物の損失につながる可能性があります。これらの問題を克服するために、遺伝子破壊法2、PCRベースのDNAスプライシング法3(指定2段階融合PCR)、遺伝子のエレクトロポレーションに続く遺伝子産物精製のための簡単な手順が開発されました。連鎖球菌変異体の変換.遺伝子産物のC終産にポリヒスチジンタグ(His-tag)を添加すると、固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による精製が容易になります。

Hisタグ発現株を単離するために、目的の遺伝子のゲノムDNA全体(このHisタグ発現遺伝子破壊株)は、抗生物質耐性マーカー遺伝子に置き換えられる。Hisタグ発現株を生成する手順は、前述の4,5のように遺伝子破壊株を生成する手順とほぼ同じである。したがって、遺伝子破壊および遺伝子産物単離の方法は、機能解析のための連続実験として行われるべきである。

本研究では、ポリヒスチジンコード配列がgtfC(GenBank遺伝子座タグSMU_1005)遺伝子の3’末端に付着し、S.ミュータンス6にグルコシルトランスフェラーゼ-SI(GTF-SI)をコードする。次いで、連鎖球菌種における発現研究を行った。大腸菌による不一相gtfC発現の達成は困難であり、GTF-SIの分子量が高いためである可能性が高い。この株はS.ミュータンスHis-gtfCと名付けられています。野生型S.mutans(S.mutans WT)およびその誘導体におけるgtfCおよびスペクチノマイシン耐性遺伝子カセット(spc r)7遺伝子の組織を示す概略図図 1.GTF-SIは、カリオ原性歯科バイオフィルム6の開発に貢献する分泌タンパク質です。ショ糖の存在下では、接着性バイオフィルムはWT S.ミュータンス株の滑らかなガラス表面で観察されるが、S.mutans gtfC-破壊株(S.mutans ΔgtfC)2、5では観察されない。.バイオフィルム形成は、組換えGTF-SIの外因性添加時にS.ミュータンスΔgtfCで復元される。 株、S.ミュータンスHis-gtfCは、次いで組換えGTF-SIを生成するために使用されます。

Protocol

注:gtfC遺伝子のコード領域全体をspcrに置き換えるS.mutansの生成は、これらのプロトコルを実行する前に完了する必要があります。ジェネレーション5の詳細については、公開された資料を参照してください。 1. プライマーデザイン S.ミュータンの建設のためのプライマーを準備する彼<em…

Representative Results

図3は、第1PCR(図3A)および第2PCR(図3B)からの各アンプリコンのサイズを示す。各アンプリコンのサイズは、表1に説明するように、予測サイズに対応しました。図4Aは、第2のPCR産物で形質転換し、スペクチノマイシンを含むBHI寒天プレート上にメッキされたS.ミュー?…

Discussion

プライマーの設計は、プロトコルの最も重要なステップです。gtfC -リバースプライマーとspcr-forward プライマーのシーケンスは、gtfC の 3′終了領域とspcrの 5′ 終了領域の両方のシーケンスに基づいて自動的に決定されました。各プライマーには、GS リンカーと 5′ リージョンの His タグ コーディング シーケンスをエンコードする 24 の相補ベースが含?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、日本学術振興会(JSPS)(助成番号16K15860、19K10471~T.M.、17K12032~N.H.、セコム科学技術振興財団(助成番号201)の支援を受けています。.

Materials

Agarose Nippon Genetics NE-AG02 For agarose gel electrophoresis
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody MBL D291-7 HRP-conjugated
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227 Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture medium
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit Sartorius VS2032 Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge Kubota 7780II
Chromatographic column Bio-Rad 7321010 For IMAC
Dialysis membrane clamp Fisher brand 21-153-100
Dialysis tubing As One 2-316-06
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing Eurofins Genomics
ECL substrate Bio-Rad 170-5060 For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0) Wako 311-90075 Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette Bio-Rad 1652086 0.2 cm gap
Electroporator Bio-Rad 1652100
EtBr solution Nippon Gene 315-90051 For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Imager GE Healthcare 29083461 For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole Wako 095-00015 Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments EZ-022 Temperature setting: 4 °C
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments LH-100-RDS Temperature setting: 37 °C
Membrane filter Merck Millipore JGWP04700 0.2 µm diameter
Microcentrifuge Kubota 3740
NaCl Wako 191-01665 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O Wako 192-02815 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH Wako 198-13765 Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4 Wako 015-06737 Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin Bio-Rad 1560133 For IMAC
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered
Protein standard Bio-Rad 161-0381 For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus As One FH-1G
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter Merckmillipore SLGV004SL 0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC Stock strain in the lab. gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159 Stock strain in the lab. S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
TAE (50 × ) Nippon Gene 313-90035 For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler Bio-Rad PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Wako 314-90065 Tris-EDTA buffer preparation

References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

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Cite This Article
Murata, T., Yamashita, M., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (151), e59804, doi:10.3791/59804 (2019).

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