Summary

Streptococcus mutans'larda Yüksek Moleküler Kütle Proteininin Saflaştırılması

Published: September 14, 2019
doi:

Summary

Burada açıklanan Streptococcus mutansbir gen ürün saflaştırma için basit bir yöntemdir. Bu teknik proteinlerin saflaştırılmasında, özellikle membran proteinlerinde ve yüksek moleküler kütle proteinlerinde avantajlı olabilir ve diğer çeşitli bakteri türleri ile birlikte kullanılabilir.

Abstract

Bir genin işlevinin açıklanması genellikle ilgi geninin bozulduğunu zinde tip suşların ve suşların fenotipik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozulmasından sonra fonksiyon kaybı, bozulan genin ürününün eksojen eklenmesiyle geri kazanılır. Bu genin işlevini belirlemek için yardımcı olur. Daha önce açıklanan bir yöntem gtfC gen sekteye uğrayan Streptococcus mutans suşu oluşturmayı içerir. Burada, gtfC gen ürününü gen bozulmasından sonra yeni üretilen S. mutans suşundan arındırmak için talepedilmeyen bir yöntem tanımlanmıştır. Bu immobilize metal afinite kromatografi kullanarak gen ürün basit saflaştırma sağlayan ilgi geninin 3 ‘ sonunda bir polihistidin kodlama dizisi nin eklenmesini içerir. Bu yöntemde genetik modifikasyon için PCR dışında enzimatik reaksiyonlara gerek yoktur. Gen bozulmasından sonra gen ürününün ekolarak restorasyonu, farklı türlere de adapte edilebilen gen fonksiyonunu belirlemek için etkili bir yöntemdir.

Introduction

Bir genin işlevinin analizi genellikle ilgi geninin bozulduğunu suşlar için yabani tip suşların fenotibik özelliklerinin karşılaştırılmasını içerir. Gen bozan suşu üretildikten sonra, gen ürününün eksojen eklenmesi fonksiyonel restorasyona olanak sağlar.

Sonraki restorasyon tahlilleri için gerekli saflaştırılmış gen ürünleri elde etmek için en yaygın yöntem Escherichia coli1heterolog ifade gerçekleştirerek gereğidir. Ancak, membran proteinleri veya yüksek moleküler kütleli proteinlerin ekspresyonu genellikle bu sistemi kullanarak zordur1. Bu gibi durumlarda, hedef protein genellikle doğal olarak gen ürün kaybına yol açabilir adımlar, karmaşık bir dizi yoluyla protein sentezler hücrelerden izole edilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, gen bozulma yöntemi2, PCR tabanlı DNA birleştirme yöntemi3 (belirlenen iki aşamalı füzyon PCR) ve genetik için elektroporasyon aşağıdaki gen ürün arınması için basit bir prosedür geliştirilmiştir Streptococcus mutansdönüşüm . Gen ürününün C-terminusuna bir polihistidin etiketi (His-tag) eklenmesi, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) ile arınmasını kolaylaştırır.

O-tag-ifade suş izole etmek için, ilgi geninin tüm genomik DNA (bu Onun etiketi ifade gen-bozulmuş suş) bir antibiyotik dirençli marker geni ile değiştirilir. His-tag-ifade gerginlik üretmek için prosedür daha önce açıklandığı gibi bir gen bozulmuş gerginlik üretmek için hemen hemen aynıdır4,5. Bu nedenle, fonksiyonel analiz için seri deney olarak gen bozulması ve gen ürün izolasyonu yöntemleri yapılmalıdır.

Bu çalışmada, bir polihistidin kodlama dizisi gtfC 3 ‘ sonuna eklenir (GenBank çekirge etiketi SMU_1005) gen, kodlama glukozyltransferase-SI (GTF-SI) S. mutans6. Daha sonra streptokok türlerinde ekspresyon çalışmaları yapıldı. E. coli ile heterolog gtfC ekspresyonuna ulaşmak, gtf-SI’nin yüksek moleküler kütlesi nedeniyle zordur. Bu tür S. mutans His-gtfC olarak adlandırılır. GtfC ve spectinomisin direnç gen kasetinin organizasyonunu gösteren şematik bir illüstrasyon (spcr) yabani tip S. mutanlarda 7 loci (S. mutans WT) ve türevleri Şekil 1. GTF-SI, karojenik dişbiyofilminingelişimine katkıda bulunan bir salgı proteinidir 6. Sakaroz varlığı altında, bir yapışık biyofilm WT S. mutans zorlanma düz bir cam yüzey üzerinde gözlenir ama S. mutans gtfC-bozulmuş suşu (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biyofilm oluşumu rekombinant GTF-SI ekselansları üzerine S. mutans ΔgtfC’de geri yüklenir. Suşu, S. mutans His-gtfC , daha sonra rekombinant GTF-SI üretmek içinkullanılır.

Protocol

1. Astar tasarımı S. mutans His-gtfCinşaatı için astar hazırlayın.NOT: Bu protokolde kullanılan astar dizileri Tablo 1’degösterilmiştir. S. mutans Üretimi için iki aşamalı füzyon PCR yöntemiHis-gtfC şematik Şekil 2’degösterilmiştir. Tasarım astarları (gtfC-ters ve spcr-ileri) His-tag kodlama dizisinin eki…

Representative Results

Şekil 3, ilk PCR(Şekil 3A)ve ikinci PCR(Şekil 3B)her bir amplicon boyutunu gösterir. Her amplicon boyutu Tablo 1’deaçıklandığı gibi, öngörülen boyutu ile karşılık gelir. Şekil 4A, ikinci PCR ürünü ile dönüştürülmüş ve spectinomisin içeren BHI agar plakaları üzerine kaplanmış S. mutans kolonilerini göstermektedir. …

Discussion

Astar tasarımı protokolün en kritik adımıdır. GTFC-reverse ve spcr-forward astarlarının dizileri, gtfC’nin 3′ son bölgesi nin ve spcr’nin5′ uç bölgesinin dizilerine göre otomatik olarak belirlenmiştir. Her astar, 5’bölgelerine bir GS bağlantı layıcısını kodlayan 24 tamamlayıcı temel ve His-tag-kodlama dizisini içerir. Yukarı yayılım bölgelerinde bulunan yerel düzenleyici dizilerin bozulması, 3′ sonuna His-tag-kodlama dizilerinin eklenm…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS) (16K15860 ve 19K10471 ile T. M., 17K12032 to M. I., ve 18K09926 to N. H.) ve SECOM Bilim ve Teknoloji Vakfı (SECOM) (sayı hibe 2018.09.10 No. 10 10) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Agarose Nippon Genetics NE-AG02 For agarose gel electrophoresis
Anaeropack Mitsubishi Gas Chemical A-03 Anaerobic culture system
Anti-His-Tag monoclonal antibody MBL D291-7 HRP-conjugated
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23227 Measurement of protein concentration
Brain heart infusion broth Becton, Dickinson 237500 Bacterial culture medium
CBB R-250 Wako 031-17922 For biofilm staining
Centrifugal ultrafiltration unit Sartorius VS2032 Buffer replacement and protein concentration
Centrifuge Kubota 7780II
Chromatographic column Bio-Rad 7321010 For IMAC
Dialysis membrane clamp Fisher brand 21-153-100
Dialysis tubing As One 2-316-06
DNA polymerase Takara R045A High-fidelity DNA polymerase
DNA sequencing Eurofins Genomics
ECL substrate Bio-Rad 170-5060 For western blotting
EDTA (0.5 M pH 8.0) Wako 311-90075 Tris-EDTA buffer preparation
Electroporation cuvette Bio-Rad 1652086 0.2 cm gap
Electroporator Bio-Rad 1652100
EtBr solution Nippon Gene 315-90051 For agarose gel electrophoresis
Gel band cutter Nippon Genetics FG-830
Gel extraction kit Nippon Genetics FG-91202 DNA extraction from agarose gel
Imager GE Healthcare 29083461 For SDS-PAGE and western blotting
Imidazole Wako 095-00015 Binding buffer and elution buffer preparation
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments EZ-022 Temperature setting: 4 °C
Incubator Nippon Medical & Chemical Instruments LH-100-RDS Temperature setting: 37 °C
Membrane filter Merck Millipore JGWP04700 0.2 µm diameter
Microcentrifuge Kubota 3740
NaCl Wako 191-01665 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaH2PO4·2H2O Wako 192-02815 Preparation of binding buffer and elution buffer
NaOH Wako 198-13765 Preparation of binding buffer and elution buffer
(NH4)2SO4 Wako 015-06737 Ammonium sulfate precipitation
Ni-charged resin Bio-Rad 1560133 For IMAC
PCR primers Eurofins Genomics Custom-ordered
Protein standard Bio-Rad 161-0381 For SDS-PAGE and western blotting
Solvent filtration apparatus As One FH-1G
Spectinomycin Wako 195-11531 Antibiotics; use at 100 μg/mL
Sterile syringe filter Merckmillipore SLGV004SL 0.22 µm diameter
Streptococus mutans ΔgtfC Stock strain in the lab. gtfC replaced with spcr
Streptococus mutans UA159 Stock strain in the lab. S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain
Sucrose Wako 196-00015 For biofilm development
TAE (50 × ) Nippon Gene 313-90035 For agarose gel electrophoresis
Thermal cycler Bio-Rad PTC-200
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) Wako 314-90065 Tris-EDTA buffer preparation

References

  1. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
  2. Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
  3. Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
  4. Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
  5. Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
  6. Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
  7. LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
  8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  9. Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  10. Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  11. Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  12. Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  13. Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  14. Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
  17. Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
  18. Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).

Play Video

Cite This Article
Murata, T., Yamashita, M., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans. J. Vis. Exp. (151), e59804, doi:10.3791/59804 (2019).

View Video