Summary

Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

Published: July 09, 2019
doi:

Summary

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Abstract

Er zijn meer dan 100 chemisch verschillende modificaties van RNA, waarvan tweederde bestaat uit methylaties. Belangstelling voor RNA-modificaties, en vooral methylaties, is opnieuw ontstaan als gevolg van de belangrijke rollen die worden gespeeld door de enzymen die ze schrijven en verwijderen in biologische processen die relevant zijn voor ziekte en kanker. Hier wordt een gevoelige in vitro assay voor een accurate analyse van RNA methylatieanalyse Writer activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde rna’s verstrekt. Deze test maakt gebruik van een tritiumhoudend vorm van S-adenosyl-methionine, resulterend in directe etikettering van gemethyleerd RNA met tritium. De lage energie van tritium straling maakt de methode veilig, en reeds bestaande methoden van tritium signaalversterking, maken het mogelijk om te kwantificeren en het gemethyleerd RNA visualiseren zonder het gebruik van antilichamen, die vaak vatbaar zijn voor artefacten. Hoewel deze methode is geschreven voor RNA-methylering, maken enkele tweaks het toepasbaar op de studie van andere RNA-modificaties die radioactief gelabeld kunnen worden, zoals RNA acetylering met 14C acetyl coenzym A. over het algemeen maakt deze assay het mogelijk om snel te beoordelen RNA methylatieaandoeningen, remming met kleine molecuul remmers, of het effect van RNA-of enzym mutanten, en biedt een krachtig hulpmiddel om de in cellen verkregen resultaten te valideren en uit te breiden.

Introduction

DNA, RNA en eiwitten zijn onderhevig aan modificaties die genexpressie1strak reguleren. Onder deze wijzigingen, en optreden op alle drie biopolymeren. DNA-en eiwithoudende methylaties zijn in de afgelopen drie decennia zeer goed bestudeerd. Daarentegen is de interesse in RNA-methylatie pas recentelijk geregend in het licht van de belangrijke rollen die eiwitten die het schrijven, wissen of binden van RNA-methylaties spelen in ontwikkeling en ziekte2. Naast beter bekende functies in de overvloedige ribosomale en overdracht RNAS, reguleren RNA methylatietrajecten specifieke boodschapper RNA stabiliteit3,4, splicing5 en vertaling6,7, Mirna verwerkt8,9 en transcriptionele onderbreken en vrijgeven10,11.

Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit in de setting van een moleculair biologie laboratorium gerapporteerd (samengevat in Figuur 1). Veel studies beoordelen de activiteit van een RNA-methyltransferase door middel van dot-Blot met een antilichaam tegen de RNA-modificatie van belang. Dot-Blot controleert echter niet de integriteit van het RNA na incubatie met het RNA-methyltransferase. Dit is belangrijk omdat zelfs kleine verontreinigingen van recombinant eiwit met nucleasen kunnen leiden tot gedeeltelijke RNA afbraak en verstorende resultaten. Bovendien kunnen zelfs zeer specifieke RNA modificatie antilichamen ongemodificeerde Rna’s herkennen met specifieke sequenties of structuren. De in vitro RNA-methyltransferase assay die hier wordt gerapporteerd, maakt gebruik van het feit dat de S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen . Instructies zijn voorzien voor in vitro transcriptie en zuivering van een transcriptie van belang en het testen van de methylatieanalyse van deze transcriptie door het enzym van de belangstelling. Deze methode is flexibel en robuust, en kan worden aangepast aan de behoeften van een bepaald project. Zo kunnen in vitro getranscribeerde en gezuiverde Rna’s, chemisch samengestelde rna’s, maar ook cellulaire Rna’s worden gebruikt. Deze test verschaft kwantitatieve informatie in de vorm van scintillatie tellingen, evenals kwalitatieve informatie door te laten zien waar precies het gemethyleerd RNA op een gel draait. Dit kan een uniek inzicht bieden in de functie van een RNA-methyltransferase, vooral bij het gebruik van cellulaire Rna’s als substraat, omdat het een methode biedt om direct de grootte van het RNA of Rna’s te observeren die gericht zijn op methylatie.

Protocol

1. in vitro transcriptie en gel zuivering van het doelwit RNA Kloon de volgorde van belangstelling in plasmiden met T7 en/of SP6 promoters met behulp van gevestigde moleculaire kloontechnieken12 of Kits. Linearisatie van de DNA-template voor in vitro transcriptie Vergroot de volgorde van belangstelling per PCR van het plasmide met primers die zijn ontworpen om de T7 Promoter regio op te nemen via de insert, + 20-30 BP stroomopwaarts en stroomafwaarts …

Representative Results

In vitro transcriptie reactieFiguur 2 A vertegenwoordigt een typische run van een in vitro transcriptie reactie met de T7 RNA polymerase van het 7Sk snrna, wat een relatief korte (331 NT) en sterk gestructureerd RNA is. Zoals weergegeven op die RAW-afbeelding, zijn er meerdere ongewenste bands, zowel korter als langer dan 7SK, waarschijnlijk als gevolg van willekeurige transcriptionele initiatie-of beëindigings gebeurtenissen. Hierdoor is gel-zuivering …

Discussion

Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit naar specifieke transcripten gerapporteerd. De assay maakt gebruik van het feit dat S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen. Het is echter belangrijk op te merken dat deze bepaling niet kan aangeven welke residu of chemische groep door het enzym wor…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Dr. Turja Kanti Debnath bedanken voor zijn hulp bij ChemDraw. Onderzoek in de Xhemalçe Lab wordt ondersteund door het ministerie van defensie-Congressionally gerichte medisch onderzoekprogramma-Breast Cancer Breakthrough Award (W81XWH-16-1-0352), NIH subsidie R01 GM127802 en start-up fondsen van het Institute of Cellular en Moleculaire biologie en het College voor natuurwetenschappen aan de Universiteit van Texas in Austin, USA.

Materials

10 bp DNA Ladder Invitrogen 10821-015 10 bp DNA Ladder kit.
10% Ammonium Persulfate (APS)  N/A N/A For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter).
10X TBE Buffer N/A N/A For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter).
10X TBS N/A N/A For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. 
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher BP1408-1 For urea denaturing polyacrylamide gel.
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) Perkin Elmer NET155V250UC For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity=
(1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.   Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes GE Healthcare RPN11649 For autoradiogram gel exposure.
Amersham Hyperfilm MP GE Healthcare 28906846 For autoradiogram gel exposure.
Beckman Scintillation Counter Beckman LS6500 For liquid scintillation count.
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System Biorad 1704466 Mini Horizontal Electrophoresis System.
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche Applied Science 4693159001 For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.
Criterion Cell Biorad 345-9902 RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.
Criterion empty Cassettes Biorad 1656001 Vertical midi-format electrophoresis cell.
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer DeNovix DS-11-S Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.
Ecoscint Original National Diagnostics LS-271 For liquid scintillation count.
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials Fisher 03-337-1 For liquid scintillation count.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer RPI CORP 112600 For autoradiogram gel pretreatment.
Gel dryer Biorad 1651745 For drying gel.
Gel Loading Buffer II Ambion AM8547 For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).
GeneCatcher disposable gel excision tips Gel Company NC9431993 For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.
Megascript Kit Ambion AM1333 For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. 
Perfectwestern Extralarge Container Genhunter Corporation NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) Gel staining box.
pRZ Addgene #27663 Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup Qiagen 74204 For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.
QIAquick Gel Extraction Kit (50) Qiagen 28704 Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.
Saran Premium Plastic Wrap Saran Wrap Amazon For drying gel.
SYBR Gold Invitrogen S11494 Ultra sensitive nucleic acid gel stain.
SYBR Safe Invitrogen S33102 Nucleic acid gel stain.
TE Sigma 93283-100ML 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0
TEMED Fisher 110-18-9 For urea denaturing polyacrylamide gel.
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES eppendorf 5382000023/5361000038 For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.
TOPO TA Cloning Kit life technologies Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.
TURBO DNase (2 U⁄µL) Ambion AM2238 For DNA removal from in vitro transcription reactions.
Urea Sigma 51456-500G For urea denaturing polyacrylamide gel.
Whatman 3MM paper GE Healthcare 3030-154 Chromatography paper for drying gel.

References

  1. Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
  2. Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
  3. Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5′ cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
  4. Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
  5. Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
  6. Meyer, K. D., et al. 5′ UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
  7. Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
  8. Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
  9. Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
  10. Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
  11. Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , (2019).
  13. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
  14. Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
  15. Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
  16. Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
  17. Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
  18. Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
  19. Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
  20. Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).

Play Video

Cite This Article
Shelton, S. B., Xhemalce, B. Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis. J. Vis. Exp. (149), e59856, doi:10.3791/59856 (2019).

View Video