RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil
Summary
Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.
Abstract
RNA ‘da 100 ‘ den fazla kimyasal olarak farklı değişiklikler vardır, üçte ikisi metilasyonlardan oluşur. RNA modifikasyonları ve özellikle metilasyonlar ile ilgili ilgi, hastalık ve kanserle ilgili biyolojik süreçlerde bunları yazarak ve silen enzimlerin oynadığı önemli roller nedeniyle yeniden ortaya çıkmıştır. Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNAs üzerinde RNA metilasyon yazar aktivitesinin doğru analizi için hassas bir in vitro tahlil sağlanır. Bu tahlil S-adenosyl-metiyonin bir tritiated formu kullanır, tritium ile metilated RNA doğrudan etiketleme sonucu. Trityum radyasyon düşük enerji yöntemi güvenli hale getirir, ve önceden mevcut trityum sinyal amplifikasyon yöntemleri, ölçmek için mümkün kılmak ve antikorlar kullanmadan metylated RNA görselleştirmek için, genellikle eserler eğilimli olan. Bu yöntem RNA metilasyonu için yazılırken, birkaç tweaks radyoaktif olarak etiketlenmiş olabilir diğer RNA modifikasyonları çalışma için geçerli hale, 14C Asetil koenzim A ile RNA asetilasyon gibi. genel olarak, bu TAHLIL hızlı RNA değerlendirmek için izin verir metilasyon koşulları, küçük molekül inhibitörleri ile inhibisyonu veya RNA veya enzim mutantlarının etkisi, hücrelerde elde edilen sonuçları doğrulamak ve genişletmek için güçlü bir araç sağlar.
Introduction
DNA, RNA ve proteinler gen ifadesi1 ‘i sıkıca düzenleyen değişikliklere tabidir. Bu değişiklikler arasında, üç biopolymers üzerinde metilasyonlar ortaya çıkar. DNA ve protein metilasyonları son üç yılda çok iyi incelenmiştir. Buna karşılık, RNA metilasyonlarının ilgi alanı sadece son zamanlarda, RNA metilasyonları yazma, silme veya bağlama proteinlerinin geliştirme ve hastalık2‘ de oynacağı önemli rollerin ışığında reignited olmuştur. Bol ribozomal ve transfer Rnas ‘da daha iyi bilinen fonksiyonlara ek olarak, RNA metilasyon yolları özel haberci RNA stabilitesi3,4, yapıştırma5 ve Translation6,7, Mirna işleme8,9 ve transkripsiyonel duraklatma ve sürüm10,11.
Burada, moleküler biyoloji laboratuarında RNA metiltransferaz aktivitesinin in vitro olarak doğrulanması için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir ( Şekil 1‘ de özetlenmiştir). Birçok çalışmada RNA ‘nın metiltransferaz aktivitesini dot-blot ile bir antikor ile bir antikorla karşılaştırın. Ancak, dot-blot RNA metiltransferaz ile kuluçka üzerine RNA bütünlüğünü doğrulamaz. Bu önemlidir, çünkü nükller ile rekombinant proteinlerin bile küçük kontaminasyonları kısmi RNA bozulması ve şok edici sonuçlara yol açabilir. Dahası, yüksek spesifik RNA Modifikasyon antikorları bile değiştirilmiş RNAs ‘ı belirli diziler veya yapılarla tanıyabilir. Burada bildirilen in vitro RNA metiltransferaz tahlil S-adenöl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeği yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin . Talimatları in vitro transkripsiyon ve faiz ve metilasyon test bir transkript arıtılması için verilir, ilgi enzim tarafından transkript söyledi. Bu yöntem esnek ve sağlamdır ve belirli bir projenin ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir. Örneğin, in vitro transkripsiyonu ve saflaştırılmış RNAs, kimyasal olarak sentezlenmiş RNAs, aynı zamanda hücresel RNAs kullanılabilir. Bu tahlil, tam olarak metilated RNA ‘nın bir jel üzerinde çalıştığı yeri göstererek nitel bilgilerin yanı sıra scintite sayar formunda niceliksel bilgiler sağlar. Bu, özellikle metilasyon için hedeflenen RNA veya RNAs boyutunu doğrudan gözlemlemek için bir yöntem sağladığı için, bir RNA metiltransferaz fonksiyonuna benzersiz bir anlayış sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, RNA metiltransferaz aktivitesinin spesifik transkriptlere yönelik in vitro doğrulama için basit ve sağlam bir yöntem bildirilmiştir. Tahlil S-adenosyl metiyonin metil grup donör üzerinde tritiated olabilir gerçeğinden yararlanır (Şekil 1), metillenmiş RNA doğru antikorlar kullanmadan algılanması için izin. Ancak, bu tahlil hangi kalıntı veya kimyasal grup enzim tarafından metillenmiş olduğunu göstermez dikkat etmek önemlidir. Belirli bir kalıntı metilasyonlu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar ChemDraw ile onun yardımı için Dr turja Kanti Debnath teşekkür etmek istiyorum. Xhemalçe laboratuvarındaki araştırmalar, Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmektedir-Kongre yönettiği tıbbi araştırma programı-meme kanseri atılım Ödülü (W81XWH-16-1-0352), NıH Grant R01 GM127802 ve mobil Enstitüsü ‘nden başlangıç fonları ve Moleküler Biyoloji ve College of Doğa Bilimleri Texas Üniversitesi ‘nde Austin, ABD.
Materials
| 10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
| 10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
| 10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
| 10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
| Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
| Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
| Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
| Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
| Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
| Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
| DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
| Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
| Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
| Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
| Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
| Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
| GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
| Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
| Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
| pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
| Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
| Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
| SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
| TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
| TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
| TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
| TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
| Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
| Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |
References
- Xhemalce, B. From histones to RNA: role of methylation in cancer. Briefings in Functional Genomics. 12 (3), 244-253 (2013).
- Shelton, S. B., Reinsborough, C., Xhemalce, B. Who Watches the Watchmen: Roles of RNA Modifications in the RNA Interference Pathway. PLoS Genetics. 12 (7), 1006139 (2016).
- Mauer, J., et al. Reversible methylation of m(6)Am in the 5′ cap controls mRNA stability. Nature. 541 (7637), 371-375 (2017).
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Pendleton, K. E., et al. The U6 snRNA m(6)A Methyltransferase METTL16 Regulates SAM Synthetase Intron Retention. Cell. 169 (5), 824-835 (2017).
- Meyer, K. D., et al. 5′ UTR m(6)A Promotes Cap-Independent Translation. Cell. 163 (4), 999-1010 (2015).
- Wang, X., et al. N(6)-methyladenosine Modulates Messenger RNA Translation Efficiency. Cell. 161 (6), 1388-1399 (2015).
- Alarcon, C. R., Lee, H., Goodarzi, H., Halberg, N., Tavazoie, S. F. N6-methyladenosine marks primary microRNAs for processing. Nature. 519 (7544), 482-485 (2015).
- Xhemalce, B., Robson, S. C., Kouzarides, T. Human RNA methyltransferase BCDIN3D regulates microRNA processing. Cell. 151 (2), 278-288 (2012).
- Jeronimo, C., et al. Systematic analysis of the protein interaction network for the human transcription machinery reveals the identity of the 7SK capping enzyme. Molecular Cell. 27 (2), 262-274 (2007).
- Liu, W., et al. Brd4 and JMJD6-associated anti-pause enhancers in regulation of transcriptional pause release. Cell. 155 (7), 1581-1595 (2013).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visual Experimentation. , (2019).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visual Experimentation. (63), e3998 (2012).
- Rong, M., Durbin, R. K., McAllister, W. T. Template strand switching by T7 RNA polymerase. Journal of Biological Chemistry. 273 (17), 10253-10260 (1998).
- Rio, D. C. Expression and purification of active recombinant T7 RNA polymerase from E. coli. Cold Spring Harb Protocols. 2013 (11), (2013).
- Shelton, S. B., et al. Crosstalk between the RNA Methylation and Histone-Binding Activities of MePCE Regulates P-TEFb Activation on Chromatin. Cell Reports. 22 (6), 1374-1383 (2018).
- Walker, S. C., Avis, J. M., Conn, G. L. General plasmids for producing RNA in vitro transcripts with homogeneous ends. Nucleic Acids Research. 31 (15), 82 (2003).
- Blazer, L. L., et al. A Suite of Biochemical Assays for Screening RNA Methyltransferase BCDIN3D. SLAS Discovery. 22 (1), 32-39 (2017).
- Arango, D., et al. Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency. Cell. 175 (7), 1872-1886 (2018).
- Ito, S., et al. Human NAT10 is an ATP-dependent RNA acetyltransferase responsible for N4-acetylcytidine formation in 18 S ribosomal RNA (rRNA). Journal of Biological Chemistry. 289 (52), 35724-35730 (2014).
