בידוד של תאים אפיתל הרוק מן הרוק בלוטות האדם עבור צמיחה מחוץ לתחום כמו סאליספירות או Monolayers
Summary
אנו מציגים שיטה לבידוד וטיפוח תאים האפיתל בלוטת הרוק העיקרי של האדם. תאים אלה התערוכה ביטוי גנים דפוסי עקבי עם אותם להיות של מוצא האפיתל הרוק ניתן לגדל כמו כדורי הריר על מטריצות קרום מרתף נגזר אנגלברב-הולם-בתאי הגידול נחיל או כמו monolayers על מנות תרבות מטופלים.
Abstract
בלוטות הרוק הם אתר של עניין משמעותי עבור החוקרים המעוניינים היבטים מרובים של המחלה האנושית. מטרה אחת של החוקרים היא לשחזר פונקציה של בלוטות ניזוק על ידי טיפולים קרינה או עקב הפתווגיות הקשורים תסמונת Sjöגרנה. המטרה השנייה של חוקרים היא להגדיר את המנגנונים שבהם וירוסים לשכפל בתוך רקמת הבלוטות שבו הם יכולים לקבל גישה נוזלי הרוק חשוב עבור הילוכים אופקית. מטרות אלה להדגיש את הצורך חזק ונגיש במודל בלוטת הרוק מבחנה שיכול להיות מנוצל על ידי חוקרים המעוניינים המוזכרים לעיל, כמו גם אזורי מחקר קשורים. כאן אנו דנים פרוטוקול פשוט כדי לבודד תאים אפיתל מבלוטות הרוק האנושי להפיץ אותם בתוך מבחנה. הפרוטוקול שלנו יכול להיות ממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של מחקרים אישיים. בקצרה, רקמת הרוק היא מכנית ואנזימטי מופרדים כדי לבודד תאים בודדים או אשכולות קטנים של תאים. בחירה עבור תאים אפיתל מתרחשת על ידי ציפוי על מטריצה קרום המרתף בנוכחות של מדיה אופטימיזציה לקידום צמיחת תאים אפיתל. ניתן לתחזק את התרבויות הללו כאשכולות תלת-ממדיים, הנקראת “כדורי הערבה”, או לגדול כמונאולייר על מנות תרבות של רקמה פלסטית. פרוטוקול זה מביא את הצמיחה של אוכלוסיית הטרוגניים בעיקר תאים אפיתל שניתן להפיץ עבור 5-8 מעברים (15-20 האוכלוסייה טווח) לפני שעברו הזדקנות הסלולר.
Introduction
ביונקים בלוטות הרוק מאורגנים 3 זוגות של בלוטות הרוק הגדולות: הפרוטיד, תת הלסת, ואת בלוטות המשנה. קיימת גם סדרה של בלוטות קטין הממוקם על הלשון ומפוזרים ברחבי חלל אוראלי1. בלוטות הגדולות אחראים נפח בצובר של רוק המיוצר2. בנוסף למתן הגנה מיקרוביאלית באמצעות גורמים מופרש, רוק חשוב בתהליך של לעיסת מזון שימון כפי שהוא עובר דרך הוושט2. ככזה, תפקוד בלוטת הרוק מייצג בעיה רפואית שבה הסובלים שאינם מסוגלים לייצר רוק מספיק נוטים יותר לפתח חלות כגון חללים שיניים או הקנאזיס אוראלי3. בנוסף, מופחתת הרוק גורמת לקושי רב יותר לאכול ולעכל את המזון בעל השפעה משמעותית על איכות החיים.
תפקוד בלוטת הרוק נמצא בעיקר בחולים הסובלים מתסמונת sjöגרנה, הפרעה אוטואימונית, או בחולים עם סרטן ראש וצוואר שעברו טיפול הקרנה3,4,5, . שישה מטרים הפרשה הפגומה acini בתוך הבלוטות כתוצאה של חסינות אוטומטית או טיפול בקרינה לא עוברים התחדשות עצמית, אשר גורמת לחולה החיים עם נזק בלתי הפיך6. המחקר של בלוטות הרוק צברה גם את תשומת הלב או החוקרים המעוניינים מנגנונים של פתוגנזה נגיפית. כמה פתוגנים, כגון cytomegalovirus ירוס האדם (מימן), בהתמדה שכפול בתוך בלוטות הרוק, אשר לאחר מכן מאפשר שידור של וירוס המתהווה למחשב מארח חדש דרך רוק7,8. לפיכך, יש צורך לא מתקיים לפתח חזק ומלא מודלים של בלוטת הרוק להתמודד ולהבין מגוון מגוון של בעיות רפואיות.
מספר דגמים של מערכת בלוטת הרוק murine שימשו נקודת התחלה כדי להבין ולאפיין את התאים האפיתל השונים היוצרים את בלוטות הרוק9,10. קיימים הבדלים ברורים ועיקריים בין בלוטות הרוק אדם מורטין11. בעיקר בלוטת הפרוטיד האנושית גדולה יותר ביחס לבלוטת הלסת התחתונה ואילו הלסת התחתונה והפרוטיד דומים הרבה בגודלם1,2,11. בעוד מונצח האדם קווי הלסת התחתונה קיים, יש חששות עיקריים כי התאים מונצח לא לשמור במדויק את הפנוטיפ של הרקמה הראשונית חששות משניים כי התאים המודרים אינם נגזרים בפועל מ אפיתל הרוק עצמו12. מסיבות אלה יש עניין וצורך ללמוד רקמת הרוק העיקרי מבני אדם.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבודד תאים אפיתל העיקרי מבלוטות הרוק האנושי לתרבות רקמות. הפרוטוקול שלנו מבוסס על יצירותיו של פרינגל ואח ‘ וטראן ואח ‘. עם שינויים שבוצעו בדרך כלל לפשט את הנהלים שלהם13,14. ראשית, בזמן שפרוטוקול טראן ואח ‘ מתקשר לדגירה ארוכה של חמש שעות לעיכול הרוק, הפרוטוקול המתוקן שלנו הצליח עם מעט כמו דגירה של שעה אחת, בדומה לזה בפרינגל ואח ‘. שנית, אנו משתמשים באנזימים שונים לצורך עיכול רקמות, בעיקר איננו משתמשים בטריפסין כפי שנעשה בשימוש בפרוטוקול Tran et al המקורי, אך במקום זאת להשתמש בתערובת של dispase ו קולגן. אנו מעדיפים להימנע מטריפסין בצעדי העיכול הראשוניים כמחקר שנערך לאחרונה, הציע כי העיכול הראשוני של רקמת הרוק על ידי טריפסין תוצאות מופחתת הכדאיות התא, ואולי על ידי אובדן של אוכלוסיה נדירה של תאי גזע15. לבסוף, אנו התרבות הערבה על פני השטח של מטריקס קרום המרתף (BMM) באמצעות מדיה זמין מסחרית ניסח במקור עבור התפשטות של תאים אפיתל הסימפונות. הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לבודד את תאי הרוק מן הפרוטיד, הלסת התחתונה, ובלוטות תת לשוני. תאים אלה לבטא עמילז הרוק ו גנים ספציפיים אחרים הרוק המציין כי הם שומרים על פנוטיפ דומה לזה של תאים הרוק האפיתל שכבתית7. הצלחנו להפיק בהצלחה תרבויות הרוק מ > 50 דגימות הרקמות האנושיות הראשיות באמצעות מתודולוגיה זו. יתר על כן, התאים הרוק העיקרי יכול בקלות להיות הקפאת שמורות לשימוש במועד מאוחר יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
תפקוד הרוק מייצג דאגה לאיכות החיים עבור אלה הסובלים מתסמונת sjöגרנה, כמו גם אלה שעברו טיפול הקרנות סרטן בסמוך לבלוטות הרוק3,4,5, . שישה עשרה אחד הציע טיפול כדי לטפל בחולים אלה היא לגדל תאים גזע הרוק פונקציונלי או אורגנואיד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוני להודות לג פ. ברידג על מתן הדרכה משמעותית למתודולוגיות המעורבות בתאים ראשוניים של מעגלי התפירה. מתיו J. ביופורד היה נתמך על ידי המכונים הלאומיים של מלגת הכשרת בריאות T32-ES007250. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R01-AI121028 ו R21-DE026267 הוענק לוויליאם E. מילר.
Materials
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren’s syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
