Summary

Изоляция слюнных эпителиальных клеток от слюнных желез человека для роста провитроки как салисферы или монослои

Published: July 15, 2019
doi:

Summary

Мы представляем метод изоляции и культивирования первичных клеток эпителии, полученных из слюнных желез человека. Эти клетки демонстрируют модели экспрессии генов, согласующиеся с их слюнным эпителиальным происхождением, и могут быть выращены в виде салисферов на мембранных матрицах подвала, полученных из опухолевых клеток Энгельбрета-Хольма-Срой или в качестве монослойных на обработанных культурных блюдах.

Abstract

Слюнные железы являются местом значительный интерес для исследователей, заинтересованных в различных аспектах болезни человека. Одной из целей исследователей является восстановление функции желез, поврежденных лучевой терапией или из-за патологий, связанных с синдромом Шегрена. Вторая цель исследователей заключается в определении механизмов, с помощью которых вирусы размножаются в железистой ткани, где они могут затем получить доступ к слюнных жидкостей, важных для горизонтальной передачи. Эти цели подчеркивают необходимость надежной и доступной модели слюнных желез in vitro, которая может быть использована исследователями, заинтересованными в вышеупомянутых, а также смежных областях исследований. Здесь мы обсуждаем простой протокол для изоляции эпителиальных клеток из человеческих слюнных желез и распространять их в пробирке. Наш протокол может быть дополнительно оптимизирован для удовлетворения потребностей отдельных исследований. Вкратце, слюнная ткань механически и enzymatically отделена к изолировать одиночные клетки или малые кластеры клеток. Выбор эпителиальных клеток происходит путем покрытия на подвальной мембранной матрицы в присутствии средств оптимизированы для содействия росту эпителиальных клеток. Эти образовываемые культуры можно поддерживать как трехмерные кластеры, называемые «салисферами», или выращенные в качестве монослойного на обработанных блюдах культуры пластиковой ткани. Этот протокол приводит к росту неоднородной популяции в основном эпителиальных клеток, которые могут распространяться в течение 5-8 проходов (15-20 удвоений населения) до прохождения клеточного сенесценции.

Introduction

У млекопитающих слюнные железы организованы в 3 пары основных слюнных желез: околоушные, подчелюстные и сублингвальные железы. Существует также ряд мелких желез, расположенных на языке и разбросанных по всей полости рта1. Основные железы несут ответственность за объем слюны производится2. В дополнение к обеспечению защиты противомикробных препаратов с помощью секретных факторов, слюна имеет важное значение в процессе жевания и смазки пищи, как она проходит через пищевод2. Таким образом, дисфункция слюнных желез представляет собой медицинский вопрос, где больные, которые не в состоянии производить достаточно слюны более склонны к развитию заболеваний, таких как полости зубов или устного кандидоза3. Кроме того, снижение слюны приводит к большей сложности еды и переваривания пищи, что оказывает значительное влияние на качество жизни.

Дисфункция слюнных желез в первую очередь встречается у пациентов, страдающих синдромом Шегрена, аутоиммунным расстройством, или у пациентов с раком головы и шеи, которые подверглись лучевой терапии3,4,5, 6. Поврежденные секреторные ацини в железах в результате аутоиммунных или лучевой терапии непроходят самообновления, что приводит к тому, что пациент живет с необратимым повреждением 6. Изучение слюнных желез также привлекло внимание или исследователей, заинтересованных в механизмах вирусного патогенеза. Некоторые патогенные микроорганизмы, такие как цитомегаловирус человека (HCMV), постоянно размножаются в слюнных железах, что позволяет передавать зарождающийся вирус новому хозяину через слюну7,8. Таким образом, существует неудовлетворенная потребность в разработке надежных и воспроизводимых моделей in vitro ткани слюнных желез для решения и понимания широкого спектра медицинских проблем.

Несколько моделей системы слюнных желез мины были использованы в качестве отправной точки для понимания и характеристики различных эпителиальных клеток, которые образуют слюнные железы9,10. Существуют очевидные и основные различия между человеческими и муриновыми слюнными железами11. Наиболее примечательно человеческого околоушной железы больше по отношению к submandibular железы в то время как мышь submandibular и околоушной очень похожи по размеру1,2,11. Хотя увековеченные человеческие подмандибулярные клеточные линии существуют, есть серьезные опасения, что увековеченные клетки не точно поддерживают фенотип первичной ткани и вторичные опасения, что увековеченные клетки на самом деле не являются производными от слюнный эпителий сам12. По этим причинам существует интерес и необходимость изучения первичной слюнной ткани у человека.

Здесь мы описываем протокол для изоляции первичных эпителиальных клеток из слюнных желез человека для культуры тканей. Наш протокол основан на работах Pringle et al. и Tran et al. с изменениями, внесенными, чтобы в целом упростить их процедуры13,14. Во-первых, в то время как протокол Tran et al. требует длительной пятичасовой инкубации для ферментативного переваривания слюнной ткани, наш измененный протокол был успешным с всего лишь один час инкубации, аналогичной той, что в Pringle и др. Во-вторых, мы используем различные ферменты для пищеварения тканей, прежде всего мы не используем трипсин, как это используется в оригинальном протоколе Tran et al., но вместо этого используем смесь диспазы и коллагеназы. Мы предпочитаем, чтобы избежать трипсина в начальных шагов пищеварения, как недавнее исследование показало, что первоначальное пищеварение слюнной ткани трипсин приводит к снижению жизнеспособности клеток, возможно, в результате потери редкой популяции стволовых клеток15. Наконец, мы культуры салисферы на поверхности подвальной мембранной матрицы (БММ) с использованием коммерчески доступных средств массовой информации, первоначально разработанных для распространения бронхиальных эпителиальных клеток. Наш протокол может быть использован для изолировать слюнные клетки от околоушных, подчелюстных и сублингвальных желез. Эти клетки выражают слюнную амилазу и другие специфические гены слюны, указывающие на то, что ониподдерживают фенотип, похожий на слюнные асинарные эпителиальные клетки 7. Мы успешно создали слюнные культуры из основных образцов тканей человека с помощью этой методологии. Кроме того, первичные слюнные клетки могут быть легко криоконсервированы для использования на более поздний срок.

Protocol

Эти протоколы и исследования были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом при Университете Цинциннати (Federal-wide Assurance #00003152, протокол IRB 2016-4183). Слюнная ткань обычно резекционируется во многих хирургических процедурах головы и шеи и, как правило, не связана с злок?…

Representative Results

Через два-три дня после покрытия клеток из переваренной ткани на БММ, клетки будут легко образовывать небольшие кластеры, которые будут продолжать расширяться в размерах до 15-20 клеток на кластер(рисунок 2A). Сотовый мусор и отдельные мертвые клетки, как ?…

Discussion

Слюнная дисфункция представляет собой заботу о качестве жизни для тех, кто страдает от синдрома Шегрена, а также тех, кто проходит лучевую терапию для рака, прилегающих к слюнных желез3,4,5, 16. Один из предлагаемых тера?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить Джеймса. Бриджеса за предоставление значительных рекомендаций по методологиям, участвующим в культивирование первичных ячеек. Мэтью Дж.Биклер был поддержан Национальными институтами здравоохранения Обучение Грант T32-ES007250. Эта работа была также поддержана Национальными институтами здравоохранения грантов R01-AI121028 и R21-DE026267 присуждается Уильям У. Миллер.

Materials

100 mm culture dishes Thermo Scientific 172931
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339651
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media Lonza CC-3171 Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh Fisher 22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum Gibco 12676-029
Collagenase type III Worthington LS004182 Store at 4 °C.
Cryogenic Tube Fisher 5000-0020
Dispase Cell Applications 07923 Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors Fisher 08-940
Dulbecco phosphate buffered saline Corning 55-031-PC
General Chemicals Sigma
PathClear Basement membrane extract Cultrex 3432-005-01 Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes Falcon 353046
Surgical forceps Fisher 22-079-742
Trypsin-EDTA solution Corning 25-052-CI

References

  1. Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
  2. Holmberg, K. V., Hoffman, M. P., Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. 24, 1-13 (2014).
  3. Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
  4. Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
  5. Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren’s syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
  6. Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
  7. Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
  8. Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
  9. Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
  10. Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
  11. Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
  12. Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
  13. Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
  14. Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  15. Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
  16. Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
  17. Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
  18. Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
  19. Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
  20. Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
  21. Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).

Play Video

Cite This Article
Beucler, M. J., Miller, W. E. Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers. J. Vis. Exp. (149), e59868, doi:10.3791/59868 (2019).

View Video