Calvarial-Modell der Knochenvergrößerung bei Kaninchen zur Beurteilung des Knochenwachstums und der Neovaskularisation in Knochensubstitutionsmaterialien
Summary
Hier stellen wir ein operationschirurgisches Protokoll bei Kaninchen vor, mit dem Ziel, Knochensubstitutionsmaterialien in Bezug auf die Knochenregenerationskapazitäten zu bewerten. Durch die Verwendung von PEEK-Zylindern, die an Kaninchenschädeln befestigt sind, können Osteokontintion, Osteoinduktion, Osteogenese und Vaskulogenese, die durch die Materialien induziert werden, entweder an lebenden oder eingeschläferten Tieren bewertet werden.
Abstract
Das Grundprinzip des Kaninchen-Kalvarialmodells ist es, neues Knochengewebe vertikal auf dem kortikalen Teil des Schädels zu züchten. Dieses Modell ermöglicht die Beurteilung von Knochensubstitutionsmaterialien für die mund- und craniofacial Knochenregeneration in Bezug auf Knochenwachstum und Neovaskularisationsunterstützung. Sobald die Tiere beästhetisiert und belüftet sind (Endotrachealintubation), werden vier Zylinder aus Polyetherketon (PEEK) auf den Schädel geschraubt, auf beiden Seiten des Medians und der koronalen Nähte. Innerhalb des durch jeden Zylinder begrenzten Knochenbereichs werden fünf intramedulläre Löcher gebohrt, die den Zufluss von Knochenmarkzellen ermöglichen. Die Materialproben werden in die Zylinder gelegt, die dann geschlossen werden. Schließlich wird die chirurgische Stelle vernärst, und die Tiere werden geweckt. Das Knochenwachstum kann an lebenden Tieren mittels Mikrotomographie beurteilt werden. Sobald Tiere eingeschläfert werden, können Knochenwachstum und Neovaskularisation mittels Mikrotomographie, Immunhistologie und Immunfluoreszenz bewertet werden. Da die Auswertung eines Materials eine maximale Standardisierung und Kalibrierung erfordert, erscheint das Kalvarimodell ideal. Der Zugang ist sehr einfach, Kalibrierung und Standardisierung werden durch den Einsatz definierter Zylinder erleichtert und vier Proben können gleichzeitig bewertet werden. Darüber hinaus kann eine Live-Tomographie verwendet werden, und letztendlich ist mit einem starken Rückgang der einzuschläfernden Tiere zu rechnen.
Introduction
Das kalvariale Modell der Knochenaugmentation wurde in den 90er Jahren mit dem Ziel entwickelt, das Konzept der geführten Knochenregeneration (GBR) im mund- und kraniofazianischen chirurgischen Bereich zu optimieren. Das Grundprinzip dieses Modells ist es, neues Knochengewebe vertikal auf dem kortikalen Teil des Schädels zu züchten. Dazu wird ein Reaktor (z. B. Titan-Dome, -Zylinder oder -Käfig) auf den Schädel fixiert, um die durch ein Transplantat durchgeführte Knochenregeneration (z. B. Hydrogel, Knochenersatz usw.) zu schützen. Mit Hilfe dieses Modells, Titan oder Keramik Käfige1,2,3,4,5,6, GBR Membranen7,8,9 ,10, osteogene Faktoren11,12,13,14,15,16,17, neuer Knochen ersatz12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 oder der Mechanismus der Neovaskularisation während des Knochenregenerationsprozesses30 wurden bewertet.
Aus translationaler Sicht stellt das Kalvarimodell einen Einwandfehler dar, der mit einem Fehler der Klasse IV im Kiefer31verglichen werden kann. Ziel ist es, neuen Knochen über einem kortikalen Bereich zu züchten, ohne seitliche Unterstützung durch endogene Knochenwände. Das Modell ist somit extrem streng und bewertet das reale Potenzial vertikaler Osteokongation über den kortikalen Teil des Knochens. Wenn das hier beschriebene Modell in erster Linie der Beurteilung von Osteokontinition in Knochenersatzstoffen gewidmet ist, können auch Osteogenese und/oder Osteoinduktion enthoben werden, sowie Vaskulogenese1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
Im Wesentlichen aus ethischen, praktischen und wirtschaftlichen Gründen wurde das kalvariale Modell beim Kaninchen entwickelt, bei dem der Knochenstoffwechsel und die Knochenstruktur im Vergleich zum Menschen durchaus relevantsind. Von den 30 oben genannten Referenzen verwendeten 80% das Kaninchen-Kalvarimodell1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, was die Relevanz dieses Tiermodells demonstriert. 2008 übertrug die Busenlechner-Gruppe das Kalvarimodell auf das Schwein, um den Vergleich von acht Knochenersatzstoffen gleichzeitig20 zu ermöglichen (im Vergleich zu zwei Knochenersatzstoffen mit dem Kaninchen). Auf der anderen Seite hat unsere Gruppe das Kaninchen-Kalvarialmodell auf Schafe übertragen. Kurz gesagt, wurden Titankuppeln auf Schafschädel gelegt, um die Osteokontisierung eines neuen 3D-gedruckten Knochenersatzes zu charakterisieren. Diese Studien ermöglichten es uns, das kalvariale Modell und seine Analyse zu entwickeln und zu meistern16,21.
Die letzten drei studien zitiert16,20,21, zusammen mit mehreren anderen Untersuchungen12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, bestätigt das große Potenzial des Kalvarimodells als Screening und Charakterisierung modell. Obwohl die erzielten Ergebnisse recht zufriedenstellend waren, wiesen sie auch auf einige Einschränkungen hin: (1) Die Verwendung von Titankuppeln, die die Röntgendiffusion und damit die Live-Mikro-CT-Nutzung verhinderten. Diese konnten vor der histologischen Verarbeitung nicht entfernt werden, was die Forscher zwang, die Proben in Polyharz (Methylmethacrylat)-Harz (PMMA) einzubetten. Die daraus resultierenden Analysen beschränkten sich daher weitgehend auf die Topographie. (2) Hohe finanzielle Kosten, insbesondere wegen der Kosten der Tiere, und Kosten im Zusammenhang mit der Logistik, Wartung und der Operation der Tiere. (3) Schwierigkeiten bei der Erlangung ethischer Zulassungen für große Tiere.
Eine aktuelle Studie von Polo, et al.26 hat das Modell auf dem Kaninchen weitgehend verbessert. Titankuppeln wurden durch verschließbare Zylinder ersetzt, die mit einem konstanten Materialvolumen gefüllt werden konnten. Vier dieser Zylinder wurden auf Kaninchenschädel gelegt. Nach Fertigstellung konnten die Zylinder entfernt werden, so dass Biopsien metallfrei waren, was viel mehr Flexibilität bei der Probenverarbeitung einführte. Das Kaninchen-Kalvarialmodell wurde attraktiv für gleichzeitige Tests mit geringeren Kosten, einfache Tierhandhabung und Erleichterung der Probenverarbeitung. Unter Ausnutzung dieser jüngsten Entwicklungen haben wir das Modell weiter verbessert, indem wir Titan durch PEEK ersetzt haben, um Zylinder herzustellen, wodurch die Röntgendiffusion und der Einsatz von Mikrotomographie bei lebenden Tieren ermöglicht wurden.
In diesem Artikel werden wir die Anästhesie- und Operationsprozesse beschreiben und Beispiele für Outputs zeigen, die mit diesem Protokoll erzielt werden können, d.h. (Immun-)Histologie, Histomorphometrie, Live- und Ex-vivo-Mikrotomographie zur Bewertung der Mechanismen von Knochen und quantifizieren die neue Knochensynthese, die durch Knochenersatzmaterialien unterstützt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Modell ist einfach und sollte ganz einfach entwickelt werden, solange alle Schritte befolgt werden und die Ausrüstung geeignet ist. Da es sich bei dem beschriebenen Protokoll um eine chirurgische Methode handelt, erscheinen alle Schritte kritisch und müssen ordnungsgemäß befolgt werden. Es ist wichtig, für Tierversuche ausgebildet zu werden, insbesondere im Umgang mit Kaninchen und anästhesie. Zögern Sie nicht, professionelle Anästhesistin und tierärztliche Hilfe zu bitten. Es ist wichtig, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren sind der Geistlich AG (Wolhusen, CH) und der Osteology Foundation (Lucerne, CH) (Zuschuss Nr. 18-049) für ihre Unterstützung sowie Global D (Brignais, FR) für die Bereitstellung der Schrauben dankbar. Ein besonderer Dank geht an Dr. B. Schaefer aus Geistlich. Wir danken auch Eliane Dubois und Claire Herrmann für ihre hervorragende histologische Verarbeitung und ihre wertvollen Ratschläge. Abschließend würdigen wir Xavier Belin, Sylvie Roulet und das gesamte Team von Pr Walid Habre, “experimentelle Chirurgie Dpt”, für ihre bemerkenswerte technische Unterstützung.
Materials
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
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