Modelo Calvarial de Aumento Óseo en Conejo para Evaluación del Crecimiento Óseo y Neovascularización en Materiales de Sustitución Ósea
Summary
Aquí presentamos un protocolo quirúrgico en conejos con el objetivo de evaluar materiales de sustitución ósea en términos de capacidades de regeneración ósea. Mediante el uso de cilindros PEEK fijados en cráneos de conejo, osteoconducción, osteoinducción, osteogénesis y vasculogénesis inducidas por los materiales pueden evaluarse ya sea en animales vivos o eutanasiados.
Abstract
El principio básico del modelo calvarial de conejo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Este modelo permite la evaluación de materiales de sustitución ósea para la regeneración ósea oral y craneofacial en términos de crecimiento óseo y apoyo de neovascularización. Una vez que los animales son anestesiados y ventilados (intubación endotraqueal), cuatro cilindros de cetona de éter de poliéter (PEEK) se atornillan sobre el cráneo, a ambos lados de la mediana y coronal suturas. Se perforan cinco agujeros intramedulares dentro del área ósea delimitada por cada cilindro, lo que permite la afluencia de células de médula ósea. Las muestras de material se colocan en los cilindros que luego se cierran. Finalmente, se sutura el sitio quirúrgico, y los animales se despiertan. El crecimiento óseo puede evaluarse en animales vivos mediante microtomografía. Una vez que los animales son eutanasiados, el crecimiento óseo y la neovascularización pueden evaluarse mediante microtomografía, inmunohistología e inmunofluorescencia. Como la evaluación de un material requiere la máxima estandarización y calibración, el modelo calvarial parece ideal. El acceso es muy fácil, la calibración y la estandarización se facilitan mediante el uso de cilindros definidos y se pueden evaluar cuatro muestras simultáneamente. Además, se puede utilizar una tomografía viva y, en última instancia, se puede prever una gran disminución de animales a eutanasiar.
Introduction
El modelo calvarial de aumento óseo fue desarrollado en los años 90 con el objetivo de optimizar el concepto de regeneración ósea guiada (GBR) en el dominio quirúrgico oral y craneofacial. El principio básico de este modelo es cultivar nuevo tejido óseo verticalmente en la parte superior de la parte cortical del cráneo. Para ello, un reactor (por ejemplo, titanio -dome, -cilindro o -jaula) se fija en el cráneo para proteger la regeneración ósea llevada a cabo por un injerto (por ejemplo, hidrogel, sustituto óseo, etc.). Con la ayuda de este modelo, jaulas de titanio o cerámica1,2,3,4,5,6, membranas GBR7,8,9 ,10, factores osteogénicos11,12,13,14,15,16,17, hueso nuevo suplentes12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 o el mecanismo de neovascularización durante el proceso de regeneración ósea30 se evaluaron.
Desde un punto de vista traslacional, el modelo calvarial representa un defecto de una pared que se puede comparar con un defecto de clase IV en la mandíbula31. El objetivo es cultivar hueso nuevo por encima de una zona cortical, sin ningún apoyo lateral de las paredes óseas endógenas. Por lo tanto, el modelo es extremadamente estricto y evalúa el potencial real de la osteoconducción vertical sobre la parte cortical del hueso. Si el modelo descrito en el presente documento se dedica principalmente a la evaluación de la osteoconducción en sustitutos óseos, también se puede evaluar la osteogénesis y/o la osteoinducción, así como la vasculogénesis1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
Esencialmente por razones éticas, prácticas y económicas, el modelo calvarial fue desarrollado en el conejo en el que el metabolismo óseo y la estructura son bastante relevantes en comparación conel humano 32. De las 30 referencias citadas anteriormente, el 80% utilizó el conejo calvarial modelo1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, demostrando así la relevancia de este modelo animal. En 2008, el grupo Busenlechner transfirió el modelo calvarial al cerdo, para permitir la comparación de ocho sustitutos óseos simultáneamente20 (en comparación con dos sustitutos óseos con el conejo). Por otro lado, nuestro grupo transfirió el modelo calvarial de conejo a las ovejas. En resumen, las cúpulas de titanio se colocaron en cráneos de oveja para caracterizar la osteoconducción de un nuevo sustituto óseo impreso en 3D. Estos estudios nos permitieron desarrollar y dominar el modelo calvarial y su análisis16,21.
Los tres últimos estudios citaron16,20,21, junto con varias otras investigaciones12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, confirmó el gran potencial del modelo calvarial como cribado y caracterización Modelo. Sin embargo, a pesar de que los resultados obtenidos fueron bastante satisfactorios, también señalaron algunas limitaciones: (1) El uso de cúpulas de titanio, que impidieron la difusión de rayos X y a su vez el uso vivo de micro-CT. Estos no pudieron ser eliminados antes del procesamiento histológico, obligando a los investigadores a incrustar las muestras en resina de poli(metilmetacrilato) (PMMA). Por lo tanto, los análisis resultantes se limitaron en gran medida a la topografía. (2) Altos costos financieros, especialmente debido al costo de los animales, y los costos relacionados con la logística, el mantenimiento y la cirugía de los animales. (3) Dificultades para obtener aprobaciones éticas para animales grandes.
26 mejoró en gran medida el modelo del conejo. Las cúpulas de titanio fueron reemplazadas por cilindros closables que podían llenarse con un volumen constante de material. Cuatro de estos cilindros fueron colocados en cráneos de conejo. Al finalizar, los cilindros podían retirarse para que las biopsias estuvieran libres de metales, introduciendo mucha más flexibilidad en cuanto al procesamiento de muestras. El modelo calvarial de conejo se volvió atractivo para pruebas simultáneas con menores costos, fácil manejo de animales y facilitación del procesamiento de muestras. Aprovechando estos desarrollos recientes, hemos mejorado aún más el modelo reemplazando el titanio por PEEK para producir cilindros, permitiendo así la difusión de rayos X y el uso de microtomografía en animales vivos.
En este artículo, describiremos los procesos de anestesia y cirugía y mostraremos ejemplos de salidas que se pueden obtener utilizando este protocolo, es decir, histología (inmuno), histomorfometría, microtomografía en vivo y ex vivo para evaluar los mecanismos del hueso regeneración y cuantificar la nueva síntesis ósea apoyada por materiales sustitutivos óseos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo descrito en este documento es simple y debe desarrollarse con bastante facilidad siempre y cuando se sigan todos los pasos y el equipo sea adecuado. Como el protocolo descrito es un método quirúrgico, todos los pasos parecen críticos y deben seguirse correctamente. Es fundamental ser entrenado para experimentos con animales, especialmente en el manejo de conejos y la anestesia. No dude en pedir ayuda anestesista y veterinaria profesional. Es fundamental insistir en el monitoreo visual diario de los animales …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están en deuda con Geistlich AG (Wolhusen, CH) y la fundación Osteología (Lucerne, CH) (concesión no 18-049) por su apoyo, así como Con El Global D (Brignais, FR) para el suministro de los tornillos. Un agradecimiento particular va a dr. B. Schaefer de Geistlich. También estamos agradecidos a Eliane Dubois y Claire Herrmann por su excelente procesamiento histológico y sus valiosos consejos. Por último, reconocemos calurosamente a Xavier Belin, Sylvie Roulet y a todo el equipo de Pr Walid Habre, “cirugía experimental Dpt”, por su notable asistencia técnica.
Materials
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
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