Modello calvariale di aumento osseo nel coniglio per la valutazione della crescita ossea e della neovascolarizzazione nei materiali di sostituzione ossea
Summary
Qui presentiamo un protocollo chirurgico nei conigli con l’obiettivo di valutare i materiali di sostituzione ossea in termini di capacità di rigenerazione ossea. Utilizzando cilindri PEEK fissati su teschi di coniglio, osteoconduzione, osteoinduzione, osteogenesi e vasculogenesi indotta dai materiali possono essere valutati su animali vivi o eutanasia.
Abstract
Il principio di base del modello calvariale del coniglio è quello di far crescere il nuovo tessuto osseo verticalmente sopra la parte corticale del cranio. Questo modello consente la valutazione dei materiali di sostituzione ossea per la rigenerazione ossea orale e craniofacciale in termini di crescita ossea e supporto neovascolare. Una volta che gli animali sono anestesizzati e ventilati (intubazione endotracheale), quattro cilindri in etere chetone (PEEK) sono avvitate sul cranio, su entrambi i lati delle suture mediane e coronali. Cinque fori intramedullari sono perforati all’interno dell’area ossea delimitata da ogni cilindro, consentendo l’afflusso di cellule del midollo osseo. I campioni di materiale vengono collocati nei cilindri che vengono poi chiusi. Infine, il sito chirurgico viene suturato e gli animali si risvegliano. La crescita ossea può essere valutata sugli animali vivi utilizzando la microtomografia. Una volta che gli animali sono eutanasia, la crescita ossea e la neovascolarizzazione possono essere valutate utilizzando microtomografia, immuno-istologia e immunofluorescenza. Poiché la valutazione di un materiale richiede la massima standardizzazione e calibrazione, il modello calvariale appare ideale. L’accesso è molto semplice, la calibrazione e la standardizzazione sono facilitate dall’uso di cilindri definiti e quattro campioni possono essere valutati simultaneamente. Inoltre, la tomografia viva può essere utilizzata e, in ultima analisi, si può prevedere una grande diminuzione degli animali da eutanasia.
Introduction
Il modello calvariale di aumento osseo è stato sviluppato negli anni ’90 con l’obiettivo di ottimizzare il concetto di rigenerazione ossea guidata (GBR) nel dominio chirurgico orale e craniofacciale. Il principio di base di questo modello è quello di far crescere il nuovo tessuto osseo verticalmente sopra la parte corticale del cranio. A tale scopo, un reattore (ad esempio, titanio -dome, -cilindro o -gabbia) è fissato sul cranio per proteggere la rigenerazione ossea condotta da un innesto (ad esempio, idrogel, sostituto osseo, ecc.). Con l’aiuto di questo modello, le gabbie in titanio o ceramica1,2,3,4,5,6, gbR membrane7,8,9 ,10, fattori osteogenici11,12,13,14,15,16,17, nuovo osso sostituisce12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 Mi lasa’ di , 25 mi lato , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28 mi la più del 24 , 29 o il meccanismo di neovascolarizzazione durante il processo di rigenerazione ossea30.
Dal punto di vista traslazionale, il modello calvariale rappresenta un difetto di una parete che può essere paragonato a un difetto di classe IV nella mascella31. L’obiettivo è quello di far crescere un nuovo osso sopra un’area corticale, senza alcun supporto laterale da pareti ossee endogene. Il modello è quindi estremamente rigoroso e valuta il reale potenziale dell’osteoconduzione verticale sulla parte corticale dell’osso. Se il modello qui descritto è principalmente dedicato alla valutazione dell’osteoconduzione nei sostituti ossei, l’osteogenesi e/o l’osteoinduzione possono essere valutati, così come vasculogenesi1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
Essenzialmente per motivi etici, pratici ed economici, il modello calvariale è stato sviluppato nel coniglio in cui il metabolismo osseo e la struttura sono abbastanza rilevanti rispetto all’uomo32. Dei 30 riferimenti citati in precedenza, l’80% ha utilizzato il modello calvariale del coniglio1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, dimostrando così la rilevanza di questo modello animale. Nel 2008, il gruppo Busenlechner ha trasferito il modello calvariale al maiale, per consentire il confronto di otto sostituti ossei contemporaneamente20 (rispetto a due sostituti ossei con il coniglio). D’altra parte, il nostro gruppo ha trasferito il modello calvarialdi del coniglio alle pecore. In breve, le cupole di titanio sono state poste su teschi di pecora per caratterizzare l’osteoconduzione di un nuovo sostituto osseo stampato in 3D. Questi studi ci hanno permesso di sviluppare e padroneggiare il modello calvariale e la sua analisi16,21.
Gli ultimi tre studi citi16,20,21, insieme a diverse altre indagini12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, ha confermato il grande potenziale del modello calvariale come screening e caratterizzazione modellino. Tuttavia, anche se i risultati ottenuti sono stati abbastanza soddisfacenti, hanno anche evidenziato alcune limitazioni: (1) L’uso di cupole di titanio, che hanno impedito la diffusione dei raggi X e, a sua volta, l’uso di micro-CT dal vivo. Questi non potevano essere rimossi prima dell’elaborazione istologica, costringendo i ricercatori a incorporare i campioni nella resina poliettica (methacrita) di metiliato (PMMA). Le analisi risultanti sono state quindi in gran parte limitate alla topografia. (2) Costi finanziari elevati soprattutto a causa del costo degli animali e dei costi legati alla logistica, alla manutenzione e alla chirurgia degli animali. (3) Difficoltà nell’ottenere approvazioni etiche per gli animali di grandi dimensioni.
Un recente studio di Polo, et al.26 ha ampiamente migliorato il modello sul coniglio. Le cupole di titanio sono state sostituite da cilindri closable che potevano essere riempiti con un volume costante di materiale. Quattro di questi cilindri sono stati posizionati su teschi di coniglio. Al termine, i cilindri potevano essere rimossi in modo che le biopsie fossero prive di metalli, introducendo molta più flessibilità per quanto riguarda la lavorazione dei campioni. Il modello calvariale del coniglio è diventato interessante per i test simultanei con costi inferiori, facile gestione degli animali e facilitazione della lavorazione del campione. Approfittando di questi recenti sviluppi, abbiamo ulteriormente migliorato il modello sostituendo il titanio con PEEK per produrre cilindri, consentendo così la diffusione dei raggi X e l’uso della microtomografia su animali vivi.
In questo articolo, descriveremo i processi di anestesia e chirurgia e mostreremo esempi di uscite che possono essere ottenute utilizzando questo protocollo, cioè istologia (immuno-), istomorfometria, microtomografia viva ed ex vivo per valutare i meccanismi dell’osso rigenerazione e quantificare la nuova sintesi ossea supportata da materiali sostitutivi ossei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello qui descritto è semplice e deve essere sviluppato abbastanza facilmente fino a quando tutti i passaggi sono seguiti e l’attrezzatura è adatta. Come il protocollo descritto è un metodo chirurgico, tutti i passaggi appaiono critici e devono essere seguiti correttamente. È fondamentale essere addestrati per esperimenti sugli animali, soprattutto nella manipolazione del coniglio e nell’anestesia. Non esitate a chiedere aiuto anestesista e veterinario professionale. È fondamentale insistere sul monitoraggio vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono in debito con Geistlich AG (Wolhusen, CH) e la fondazione di Osteologia (Lucerna, CH) (grant n.18-049) per il loro sostegno, così come Global D (Brignais, FR) per la fornitura delle viti. Un ringraziamento particolare va al dottor B. Schaefer di Geistlich. Siamo anche grati a Eliane Dubois e Claire Herrmann per la loro eccellente elaborazione istologica e i loro preziosi consigli. Infine, riconosciamo calorosamente Xavier Belin, Sylvie Roulet e l’intero team di Pr Walid Habre, “chirurgia sperimentale Dpt”, per la loro notevole assistenza tecnica.
Materials
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
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