Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing
Summary
Circulaire Rna’s (Circrna’s) zijn niet-Codeer Rna’s die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.
Abstract
Circulaire Rna’s (Circrna’s) zijn een klasse van niet-Codeer Rna’s die betrokken zijn bij functies zoals micro-RNA (miRNA)-regulering, bemiddeling van eiwit-eiwit interacties en regulering van de transcriptie van ouder genen. In de klassieke volgende generatie RNA sequencing (RNA-SEQ), Circrna’s worden meestal over het hoofd gezien als gevolg van poly-een selectie tijdens de bouw van mRNA Bibliotheken, of zijn te vinden op zeer lage overvloed, en zijn daarom moeilijk te isoleren en op te sporen. Hier werd een circRNA Library Construction protocol geoptimaliseerd door het vergelijken van bibliotheek voorbereidings kits, pre-behandelingsopties en verschillende totaal RNA input bedragen. Twee in de handel verkrijgbare complete transcriptome bibliotheek voorbereidings kits, met en zonder RNase R voor behandeling, en het gebruik van variabele hoeveelheden RNA input (1 tot 4 μg), werden getest. Ten slotte, meerdere weefsel typen; waaronder lever, longen, lymfeklieren en pancreas; naast meerdere hersengebieden; met inbegrip van de cerebellum, inferieure Pariëtale kwab, middelste temporele gyrus, occipitale cortex, en superieure frontale gyrus; werden vergeleken om de overvloed van circRNA over weefsel typen te evalueren. Analyse van de gegenereerde RNA-SEQ-gegevens met behulp van zes verschillende circRNA-detectietools (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC en CIRCexplorer) onthulde dat een gestrande Total RNA Library-Voorbereidingspakket met RNase R voor behandeling en 4 μg RNA-input de optimale methode voor het identificeren van het hoogste relatieve aantal Circrna’s. In overeenstemming met eerdere bevindingen werd de hoogste verrijking van circRNAs waargenomen in hersenweefsels in vergelijking met andere weefsel typen.
Introduction
Circulaire rna’s (circrna’s) zijn endogene, niet-Codeer rna’s die aandacht hebben gekregen gezien hun pervasieve expressie in de eukaryote transcriptome1,2,3. Ze worden gevormd wanneer exonen terug-Splice aan elkaar en dus werden aanvankelijk beschouwd als splicing artefacten4,5. Recent onderzoek heeft echter aangetoond dat circrnas celtype, weefsel en ontwikkelingsfase specifieke expressie3,6 vertoont en evolutionair wordt bewaard op2,3. Bovendien zijn ze betrokken bij de bemiddeling van eiwit-eiwit interacties7, micro-RNA (Mirna) binding3,8,9,10, en regulering van ouderlijke genen transcriptie11.
In de klassieke RNA-sequencing (RNA-SEQ), kan circRNAs volledig verloren gaan tijdens de bibliotheek constructie als gevolg van poly-een selectie voor Mrna’s of kan het moeilijk zijn om te isoleren gezien hun geringe overvloed. Recente circrna-karakterisering studies hebben echter een voorbehandelings stap opgenomen met behulp van RNase R om te verrijken voor circrnas2,12,13. RNase R is een exoribonuclease die lineaire Rna’s verteerd, waardoor circulaire RNA-structuren achterblijven. CircRNA verrijking protocollen werden geoptimaliseerd door het genereren en vergelijken van gegevens van twee commercieel beschikbare hele transcriptome bibliotheek bouwkits, met en zonder een RNase R voor behandeling stap, en het gebruik van verschillende hoeveelheden totaal RNA input (1 tot 4 μg). Het geoptimaliseerde protocol werd vervolgens gebruikt om de overvloed aan Circrna’s te evalueren in vijf verschillende hersengebieden (cerebellum [BC], inferieure Pariëtale kwab [IP], middelste temporele gyrus [MG], occipitale cortex [OC] en superieure frontale gyrus [SF]) en vier andere weefsel typen (lever [LV], Long [LU], lymfeklier [LN] en alvleesklier [PA]). RNA-SEQ-bibliotheken werden gekoppeld aan de eind geordend en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van zes verschillende circrna Voorspellings algoritmen: find_circ3, ciri14, mapsplice15, Knife16, DCC17en circexplorer18. Op basis van onze analyse werd het hoogste aantal unieke Circrna’s gedetecteerd bij het gebruik van een gestrande totale RNA Library Preparation Kit met RNase R voor behandeling en 4 μg totaal input RNA. Het geoptimaliseerde protocol wordt hier beschreven. Zoals eerder gemeld19,20, de hoogste verrijking van circrnas werd waargenomen in de hersenen in vergelijking met andere weefsel soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie werden twee in de handel verkrijgbare bibliotheek voorbereidings kits, voorbehandelings opties en input RNA-bedragen getest om een circRNA-verrijkings protocol voor de bouw van circRNA-sequencing-bibliotheken te optimaliseren. Op basis van de beoordelingen van deze studie, zijn een aantal belangrijke aspecten en kritieke stappen bij het maken van circRNA-sequencing bibliotheken duidelijk. Onze evaluatie bevestigt het nut van RNase R voor behandeling, zoals weergegeven door het toegenomen aantal Circrna’s g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor de banner Sun Health Research Institute Brain and Body donatieprogramma (BBDP) van Sun City, Arizona voor de verstrekking van menselijke hersenweefsels. De BBDP is gesteund door het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte (U24 NS072026 nationale hersenen en weefsel resource voor de ziekte van Parkinson en verwante aandoeningen), het Nationaal Instituut voor veroudering (P30AG19610 Arizona Alzheimer Disease core Center), de Arizona Department of Health Services (contract 211002, Arizona Alzheimer Research Center), de Arizona Biomedical Research Commission (contracten 4001, 0011, 05-901 en 1001 aan het Arizona Parkinson disease Consortium) en de Michael J. Fox Foundation voor onderzoek van Parkinson27. Deze studie werd ook gesteund door de DHS en de staat Arizona (ADHS Grant # ADHS14-052688). We bedanken ook Andrea Schmitt (banner Research) en Cynthia lechuga (TGen) voor administratieve ondersteuning.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al. Scrambled exons. Cell. 64 (3), 607-613 (1991).
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
