Identificação de RNAs circulares usando sequenciamento de RNA
Summary
RNAs circulares (circRNAs) são RNAs não codificadores que podem ter papéis na regulação transcricional e mediar interações entre proteínas. Após a avaliação de diferentes parâmetros para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA, um protocolo foi compilado utilizando a preparação total da biblioteca de RNA com o pré-tratamento RNase R e é apresentado aqui.
Abstract
RnAs circulares (circRNAs) são uma classe de RNAs não codificadores envolvidos em funções como regulação de microRNA (miRNA), mediação de interações proteína-proteína e regulação da transcrição do gene parental. Na próxima geração clássica de sequenciamento de RNA (RNA-seq), os circRNAs são tipicamente negligenciados como resultado da seleção poli-A durante a construção de bibliotecas de mRNA, ou são encontrados em abundância muito baixa e, portanto, são difíceis de isolar e detectar. Aqui, um protocolo de construção da biblioteca circRNA foi otimizado comparando kits de preparação de bibliotecas, opções de pré-tratamento e vários valores totais de insumos de RNA. Dois kits de preparação de bibliotecas de transcriptoma inteira comercialmente disponíveis, com e sem pré-tratamento RNase R, e usando quantidades variáveis de entrada total de RNA (1 a 4 μg), foram testados. Por último, vários tipos de tecido; incluindo fígado, pulmão, nólina linfática e pâncreas; bem como várias regiões cerebrais; incluindo o cerebelo, o lóbulo parietal inferior, o giro temporal médio, o córtex occipital e o giro frontal superior; foram comparados para avaliar a abundância circRNA em todos os tipos de tecido. A análise dos dados gerados de RNA-seq usando seis ferramentas diferentes de detecção de circRNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) revelou que um kit de preparação total de biblioteca de RNA encalhado com pré-tratamento RNase R e 4 μg de entrada de RNA é o ideal método para identificar o maior número relativo de circRNAs. Consistente com os resultados anteriores, o maior enriquecimento de circRNAs foi observado em tecidos cerebrais em comparação com outros tipos de tecido.
Introduction
RNAs circulares (CircRNAs) são RNAs endógenos e não codificadores que ganharam atenção dada a sua expressão generalizada no transcriptoma eucariótico1,2,3. Eles são formados quando exons back-splice uns aos outros e, portanto, foram inicialmente considerados como estandecendo artefatos4,5. No entanto, estudos recentes demonstraram que circRNAs exibem espécies, tecidos e expressão específica em estágio de desenvolvimento3,6 e são conservadas evolutivamente2,3. Além disso, eles estão envolvidos na mediação de interações proteína-proteína7, micro-RNA (miRNA) ligação3,8,9,10, e regulação da transcrição do gene parental11.
No sequenciamento clássico de RNA (RNA-seq), os circRNAs podem estar completamente perdidos durante a construção da biblioteca como resultado da seleção poli-A para mRNAs ou podem ser difíceis de isolar, dada a sua baixa abundância. No entanto, estudos recentes de caracterização circRNA incorporaram uma etapa pré-tratamento usando RNase R, a fim de enriquecer para circRNAs2,12,13. RNase R é um exoribonuclease que digere RNAs lineares, deixando para trás estruturas circulares de RNA. Os protocolos de enriquecimento da CircRNA foram otimizados gerando e comparando dados de dois kits de construção de bibliotecas de transcriptoma inteiras comercialmente disponíveis, com e sem uma etapa pré-tratamento RNase R, e usando quantidades variáveis de entrada total de RNA (1 a 4 μg). O protocolo otimizado foi usado em seguida para avaliar a abundância de circRNAs em cinco regiões cerebrais diferentes (cerebelo [BC], lobo parietal inferior [IP], giro temporal médio [MG], córtex occipital [OC] e giro frontal superior [SF]) e quatro outros tipos de tecido (fígado [LV], pulmão [LU], nólina [LN] e pancreas [PA]). As bibliotecas de RNA-seq foram emparelhadas sequenciadas e os dados foram analisados usando seis algoritmos diferentes de previsão circRNA: find_circ3,CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17,e CIRCexplorer18. Com base em nossa análise, o maior número de circRNAs únicas foi detectado ao usar um kit de preparação total da biblioteca de RNA com pré-tratamento RNase R e RNA de entrada total de 4 μg. O protocolo otimizado é descrito aqui. Como relatado anteriormente19,20, o maior enriquecimento de circRNAs foi observado no cérebro em comparação com outros tipos de tecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, dois kits de preparação de bibliotecas comercialmente disponíveis, opções de pré-tratamento e quantidades de RNA de entrada foram testados para otimizar um protocolo de enriquecimento circRNA para a construção de bibliotecas de sequenciamento circRNA. Com base nas avaliações deste estudo, uma série de aspectos-chave e medidas críticas na criação de bibliotecas de sequenciamento circRNA são aparentes. Nossa avaliação confirma a utilidade do pré-tratamento RNase R, como refletido pelo aument…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos gratos ao Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) de Sun City, Arizona para o fornecimento de tecidos cerebrais humanos. O BBDP tem sido apoiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson’s Disease and Related Disorders), o National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona Alzheimer’s Disease Core Center), o Arizona Department of Health Services (contrato 211002, Arizona Alzheimer’s Research Center), o Arizona Biomedical Research Commission (contratos 4001, 0011, 05-901 e 1001 para o Arizona Parkinson’s Disease Consortium) e michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research27. Este estudo também foi apoiado pelo DHS e pelo Estado do Arizona (concessão adhs # ADHS14-052688). Agradecemos também a Andrea Schmitt (Banner Research) e Cynthia Lechuga (TGen) pelo apoio administrativo.
Materials
| 1000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator – 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
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