Indurre Meningococcal Meningitis Serogroup C in Topi tramite consegna intracisternale
Summary
Qui, descriviamo un metodo per indurre la meningite meningococcica attraverso una via intracisternale di infezione nei topi adulti. Vi presentiamo un protocollo passo dopo passo dell’infezione da meningococco dalla preparazione dell’inoculum all’infezione intracisternale; quindi registrare la sopravvivenza animale e valutare i carichi batterici nei tessuti murini.
Abstract
Neisseria meningitidis (meningococcus) è un microrganismo a portata stretta di ospite, riconosciuto a livello globale come la principale causa di meningite batterica. Il meningococco è un colonizzatore transitorio di nasofaringe nona l’uomo di circa il 10% del soggetto sano. In circostanze particolari, acquisisce una capacità invasiva di penetrare la barriera mucosale e invade il flusso sanguigno causando setticemia. Nell’ultimo caso, la sepsi fulminante potrebbe sorgere anche senza il conseguente sviluppo della meningite. Al contrario, i batteri potrebbero non moltiplicarsi male nel flusso sanguigno, attraversare la barriera ematoencefalica, raggiungere il sistema nervoso centrale, portando alla meningite fulminante. I modelli murini della meningite batterica rappresentano uno strumento utile per studiare le interazioni ospite-patogeno e per analizzare i meccanismi patogeni responsabili di questa malattia letale. Anche se, diversi sistemi di modelli sperimentali sono stati valutati nel corso degli ultimi decenni, nessuno di questi è stato in grado di riprodurre gli eventi patologici caratteristici della malattia meningococcica. In questo protocollo sperimentale, descriviamo una procedura dettagliata per l’induzione della meningite meningococco in un modello murino basato sull’inoculazione intracisternale dei batteri. I segni peculiari della meningite umana sono stati registrati nell’ospite murino attraverso la valutazione dei parametri clinici (ad esempio, temperatura, peso corporeo), la valutazione del tasso di sopravvivenza, l’analisi microbiologica e l’esame istologico della lesione cerebrale. Quando si utilizza l’inoculto intracisternale (i.cist.), le meningococci consegna completa direttamente in cisterna magna, portando ad una replica meningococcica molto efficiente nel tessuto cerebrale. Un aumento di 1.000 volte di conteggio praticabile di batteri è osservato in circa 18 h. Inoltre, le meningococchi si trovano anche nella milza e nel fegato dei topi infetti, suggerendo che il fegato può rappresentare un organo bersaglio per la replicazione meningococcica.
Introduction
Neisseria meningitidis è un Gram negativo – proteobacterium limitato all’ospite umano, ben noto per essere una delle cause più comuni di meningite e sepsi nella popolazione umana in tutto il mondo. Colonizza il tratto respiratorio superiore (naso e gola) di portatori sani e asintomatici (2-30% della popolazione), ma il batterio a volte elude varie difese immunitarie dell’ospite e si diffonde dal flusso sanguigno al cervello causando un locale incontrollato infiammazione, conosciuta come meningite meningococcale. Una combinazione di fattori ospiti e batterici sembra contribuire alla transizione dal comportamento commensale al comportamento invasivo1.
N. meningitidis è specializzata esclusivamente nella colonizzazione umana e nell’infezione. Ha una gamma di ospiti ristretta e, quindi, ha limitato gli studi di patogenesi in vivo a causa della mancanza di modelli animali adatti che riproducono la malattia meningococcale umana. Di conseguenza, aveva portato a lacune fondamentali nella comprensione per quanto riguarda la patogenesi della setticemia e meningite causata dal meningococco. Negli ultimi decenni, lo sviluppo di molti sistemi in vitro ha permesso l’identificazione di diversi fattori di virulenza meningococcica2,3,4. Sebbene questi preziosi studi abbiano fornito importanti informazioni per comprendere il ruolo di questi fattori per un’infezione meningococcica di successo, questi modelli non hanno permesso di valutare le conseguenze delle interazioni batteriche con l’ortore e il cellulare sistema immunitario e ancor meno con l’intero tessuto. I modelli animali in vivo di infezione sono di grande rilevanza anche per la valutazione del grado di protezione conferito dalle formulazioni del vaccino. Come patogeno umano-tropico, il meningococco possiede determinanti appropriati necessari per un’infezione di successo come le strutture superficiali (cioè, i pili di tipo IV e le proteine di opacità) e i sistemi di assorbimento del ferro per i recettori umani e le proteine di trasporto (ad es. transferrin e lattoferina)5,6,7 per aderire correttamente, sopravvivere e invadere l’ospite umano. Infine, le capacità di variazione genetica del patogeno per eludere e/o bloccare la risposta immunitaria umana contribuiscono ulteriormente al tropismo ad alta specie8,9. Pertanto, l’assenza di specifici fattori ospiti, coinvolti nell’interazione, può bloccare i passi del ciclo di vita dell’agente patogeno, stabilendo notevoli difficoltà nello sviluppo di piccoli modelli animali che riassumono il ciclo di vita meningococcico.
Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati diversi approcci per migliorare la nostra comprensione del ciclo infettivo meningococcico. Le infezioni di due modelli animali, topo e ratto, sia per via intraperitonelale (i.p.) o per intranasale (i.n.), sono state sviluppate per riprodurre la malattia meningococcica10,11,12,13,14 ,15,16,17. Il topo da laboratorio è probabilmente uno degli animali più versatili per indurre l’infezione da meningococco sperimentale.
Tuttavia, il modo di infezione i.p. porta allo sviluppo di sepsi grave anche se non imita la via naturale dell’infezione, mentre la via dell’infezione i.n. è stata utile per valutare la patogenesi meningococcica, anche se può indurre l’infezione polmonare prima della sepsi10,11,12,13,14,15,16,17.
Il modello di mouse i.p. è stato strumentale per valutare la protezione dalla sfida meningococcico10,11,12. Il modello murino della colonizzazione meningococcica basata sulla via dell’infezione i.n. è stato sviluppato con topi infantili, in quanto sono più suscettibili alle meningococchi, per riprodurre un’infezione invasiva che imita il decorso della malattia meningococcica nell’uomo 13,14,15,16,17. Inoltre, per promuovere la replicazione meningococcica nell’ospite murino, sono state applicate anche un numero crescente di strategie tecniche tra cui la somministrazione del ferro agli animali per migliorare l’infezione, l’uso di inoculumbatterico elevato , ceppo batterico del passaggio di topo e l’impiego di ospiti animali infantili o immunocompromessi10,13,15,18,19. L’espressione di fattori umani specifici come CD4620 o transferrin21 ha aumentato la suscettibilità dei topi a questo batterio umano-tropico; l’impiego del modello xenotrapianto della pelle umana è stato utile anche per valutare la capacità di adesione di meningococci all’endotelio umano22,23. Collettivamente, il recente sviluppo di topi transgenici umanizzati ha migliorato la comprensione della patogenesi meningococcica e delle sue interazioni con l’ospite.
In precedenza, abbiamo sviluppato un modello murino di meningite meningococco dove l’inoculazione dei batteri è stata eseguita nella cisterna magna di topi adulti con batteri passati daitopi 24. I parametri clinici e il tasso di sopravvivenza dei topi infetti hanno dimostrato la creazione di meningite con caratteristiche paragonabili a quelle osservate nell’ospite umano, nonché le analisi microbiologiche e istologiche del cervello. Da questi topi infetti, i batteri sono stati, anche, recuperati dal sangue, fegato, e milza, e carichi batterici da organi periferici correlati con la dose infettiva. In particolare, questo modello è stato impiegato per valutare la virulenza di un ceppo mutante isogenico difettoso nel trasportatore L-glutammato GltT24. Recentemente, utilizzando il nostro modello murino di meningite meningococcica basata su i.cist. percorso con ceppo C sierogruppo C 93/42862,24 e un mutante isogenico difettoso nella codifica genica cssA per UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase2,abbiamo analizzato il ruolo dell’acido sialico esposto nello stabilimento della malattia nei topi.
In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per indurre meningite sperimentale meningococcica basata sull’i.cist. dell’infezione nei topi adulti balb/c. Questo metodo è particolarmente utile per la caratterizzazione dell’infezione da meningococco in un ospite murino, nonché per la valutazione della virulenza tra ceppi di riferimento di tipo selvaggio e mutanti isogenici. La via intra-cisternale dell’infezione garantisce la consegna completa delle meningocci direttamente nella cisterna magna, che a sua volta facilita la replica batterica nel liquido cerebrospinale (CSF) e induce la meningite con caratteristiche che imitano quelle presentesull’uomo 2,24,25,26.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, descriviamo un protocollo sperimentale per indurre la meningite meningococcica nei topi adulti da i.cist. inoculazione di batteri meningococcici. A nostra conoscenza, nessun altro modello di meningite meningococcica è stato sviluppato in topi di laboratorio infettati da i.cist. percorso; in passato, in questo modo è stato esplorato per fornire modelli di meningite meningococcale sia in ratto31 che in coniglio32. È noto che il più alto tasso di malattia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli studi sono stati sostenuti in parte da PRIN 2012 [grant number 2012WJSX8K]: “Modelli di interazione host-microbe nelle infezioni mucosali: sviluppo di nuove strategie terapeutiche” e da PRIN 2017 [2017SFBFER]: “Un approccio integrato per affrontare l’interazione tra adattamento, condizioni stressanti e resistenza antimicrobica di agenti patogeni impegnativi”.
Materials
| 1,8 Skirted Cryovial With external thread | Starlab | E3090-6222 | |
| 50ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | 30 x 115mm |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | Stainless Steel |
| Alarm-Thermometer | TESTO | 9000530 | |
| BactoTM Proteose Peptone | BD | 211693 | |
| BD Micro Fine syringe | BD | 320837 | U-100 Insulin |
| BD Plastipak syringe 1ml 25GA 5/8in | BD | 300014 | 05x16mm |
| BD Plastipak syringe 5ml | BD | 308062 | 07 x 30mm |
| BIOHAZARD AURA B VERTICAL LAMINAR FLOW CABINET | Bio Air s.c.r.l. | Aura B3 | |
| BioPhotometer | Eppendorf | Model #6131 | |
| Bottle D | Tecniplast | D | Graduated up to:400ml, Total Volume 450ml, 72x72x122mm |
| C150 CO2 Incubator | Binder | 9040-0078 | |
| Cage Body Eurostandard Type II | Tecniplast | 1264C | 267x207x140mm, Floor area 370cm2 |
| Cell Culture Petri Dish With Lid | Thermo Scientific | 150288 | Working Volume: 5mL |
| Centrifuge | Eppendorf | Microcentrifuge 5415R | |
| Cuvetta semi-micro L. Form | Kartell S.p.A. | 01938-00 | |
| di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Carlo erba | 471767 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate anhydrous ACS-for analysis | Carlo Erba | 480141 | g1000 |
| Diete Standard Certificate | Mucedola s.r.l. | 4RF21 | Food pellet for animal |
| Dumont Hp Tweezers 5 Stainless Steel | F.S.T. by DUMONT | AGT5034 | 0,10 x 0,06 mm tip |
| Electronic Balance | Gibertini | EU-C1200 | Max 1200g, d=0,01g, T=-1200g |
| Eppendorf Microcentrifuge tube safe-lock | Eppendorf | T3545-1000EA | |
| Erythromycin | Sigma-Aldrich | E-6376 | 25g |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | Stainless Steel |
| Filter Top (mini- Isolator), H-Temp with lock clamps | Tecniplast | 1264C400SUC | |
| GC agar base | OXOID | CM0367 | |
| Gillies Forceps 1 x2 teeth | F.S.T. | 11028-15 | Stainless Steel |
| Glicerin RPE | Carlo Erba | 453752 | 1L |
| Graefe Forceps | F.S.T. | 11052-10 | Serrated Tip Width: 0.8mm |
| Inner lid | Tecniplast | 1264C116 | |
| Iron dextran solution | Sigma-Aldrich | D8517-25ML | |
| Ketamine | Intervet | ||
| Microbiological Safety Cabinet BH-EN and BHG Class II | Faster | BH-EN 2004 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | BRAND | PP780751 | screw cap PP, grad |
| Mouse Handling Forceps | F.S.T. | 11035-20 | Serrated rubber; Gripping surface:15 x 20 mm |
| Mucotit-F2000 | MERZ | 61846 | 2000ml |
| Natural Latex Gloves | Medica | M101 | |
| New Brunswick Classic C24 Incubator Shaker | PBI international | C-24 Classic Benchtop Incubator Shaker | |
| Petri PS Dishes | VWR | 391-0453 | 90X14.2MM |
| Pipetman Classic P20 | Gilson | F123600 | 2-20microL |
| Pipetman Classic P200 | Gilson | F123601 | 20-200microL |
| Pipetman Classim P1000 | Gilson | F123602 | 200-1000microL |
| Polyvitox | OXOID | SR0090A | |
| Potassium Chloride | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0208 | 250g |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | J.T. Baker Chemicals B.V. | 0240 | 1Kg |
| PS Disposible forceps | VWR | 232-0191 | |
| Removable Divider | Tecniplast | 1264C812 | |
| Round-Bottom Polypropylene Tubes | Falcon | 352063 | 5ml |
| Sodium Chloride | MOLEKULA | 41272436 | |
| SS retainer and Polyester FilterSheet | Tecniplast | 1264C | |
| Standard Pattern Forceps | F.S.T. | 11000-12 | Stainless |
| Stevens Tenotomy Scissors | F.S.T. | 14066-11 | Stainless Steel |
| Surgical Scissor – ToughCut | F.S.T. | 14130-17 | Stainless |
| Touch N Tuff disposible nitrile gloves | Ansell | 92-500 | |
| Ultra Low Temperature (ULT) Freezer | Haier | DW-86L288 | Volume= 288L |
| Wagner Scissors | F.S.T. | 14070-12 | Stainless Steel |
| Xylazine | Intervet |
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